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Este protocolo é um trecho de Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2019).
1. Imagem de cálcio in vivo
- Use um microscópio multifotônico equipado com um laser infravermelho e uma objetiva de imersão em água (consulte a Tabela de Materiais), instalado em uma mesa isolada por vibração. Para a visualização de indicadores de cálcio baseados em GFP, ajuste o laser para um comprimento de onda de excitação de 920 nm e instale um filtro passa-banda GFP.
- Usando o botão de ajuste Z grosso, escaneie o eixo Z do cérebro e localize a região cerebral de interesse. Use a função de corte para focar a digitalização apenas nessa área para minimizar o tempo de varredura e para girar a visualização de varredura de forma que a parte anterior da cabeça fique voltada para baixo.
- Ajuste o tamanho do quadro para 512 x 512 px, a velocidade de varredura para > 4 Hz e a região de varredura (na dimensão Y) para que os neurônios de interesse sejam cobertos.
2. Visualização de transientes de cálcio evocados por odor através do condicionamento olfatório
- Use um sistema de entrega de odor que possa fornecer vários estímulos de odor de maneira temporalmente precisa.
- Use um computador adicional para controlar o dispositivo e se comunicar com o software do microscópio de imagem para coordenar os estímulos de odor com a captura de imagem durante os experimentos.
- Inicie um pacote de macro pré-programado capaz de vincular o software de aquisição de imagem e o programa de entrega de odor (por exemplo, um pacote de macro VBA instalado no software de controle do microscópio, consulte Tabela de Materiais) que responda a um gatilho de entrada externo fornecido pelo início de um protocolo de entrega de odor em um programa separado).
- Inicie a medição monitorando transientes de cálcio evocados por odor "pré-treinamento"/ingênuos em uma resolução de 512 x 512 px e uma taxa de quadros de 4 Hz. Forneça um estímulo de odor de 2,5 s ladeado por aquisição de imagem adicional por 6,25 s antes do início do odor (para estabelecer um valor basal F0) e 12,5 s após o deslocamento do odor. Repita isso com um segundo odorante e depois com um terceiro odor.
- Continue 3 min após esta medição com condicionamento clássico ("treinamento") a mosca.
- Selecione um dos odores apresentados na fase de "pré-treino" para se tornar o odor CS+ e outro para se tornar o odor CS-. Apresente o odor CS+ usando o sistema de fornecimento de odor controlado por computador por 60 s ao lado de doze choques elétricos de 90 V.
- Após uma pausa de 60 s, apresente o odor CS- sozinho por 60 s. Use como odorantes 4-metilciclohexanol e 3-octanol. Não apresente o terceiro odor (por exemplo, 1-octen-3-ol) durante este treinamento, pois ele é usado como controle apenas antes (etapa 2.2.) e depois (etapa 2.4) da fase de treinamento.
- Meça os transientes de cálcio evocados por odor "pós-treino" novamente repetindo o protocolo de estimulação de odor "pré-treino" (etapa 2.2.) 3 min após terminar a fase de treinamento (etapa 2.3).
OBSERVAÇÃO: O tempo desta etapa deve refletir o tempo de interesse após a formação da memória (por exemplo, execute esta etapa 3-4 minutos após a etapa de condicionamento para investigar a memória de curto prazo). Normalmente, as moscas podem sobreviver por várias horas nesta preparação.
- Salve os arquivos de imagem em um formato apropriado (por exemplo, Tiff) para análise posterior da imagem.