$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo é um trecho de Gervaise e Arur, Análise Espacial e Temporal de ERK Ativo na Linha Germinativa de C. elegans. J. Vis.(2016).
1. Dissecção de vermes adultos para obtenção de gônadas
- Escolha 100 - 150 WT (N2) ou genótipo desejado de vermes no estágio de desenvolvimento desejado e específico (L1, L2, L3, L4, adulto, etc.) em 100 μL de tampão M9 em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Encha o tubo da microcentrífuga com 900 μL de tampão M9 (consulte a Tabela de Materiais). Centrifugue os tubos a 1.000 x g em uma microcentrífuga por 1 min em temperatura ambiente.
- Remova cuidadosamente 900 μL do tampão M9 e descarte. Remova o tampão sob um microscópio de dissecação para garantir que os vermes não sejam removidos acidentalmente.
- Repita as etapas 1.2 a 1.3 mais duas vezes com buffer M9 novo a cada vez. Isso garante que qualquer bactéria que tenha sido transportada com os vermes seja efetivamente lavada.
- Após a lavagem final, remova 900 μL de tampão M9 do tubo e descarte.
- Transfira os 100 μL restantes de tampão M9 contendo os 100 - 150 vermes com uma ponta de micropipeta de 200 μL para um prato de relógio de vidro de fundo plano. Certifique-se de que a ponta da micropipeta seja cortada na marca de 10 μL antes de usar. Não cortar a ponta resultará no cisalhamento dos vermes.
- Adicione 1 - 3 μL de levamisol 0,1 M ao prato de vidro contendo os vermes no tampão M9. Gire suavemente o levamisol e o M9 para permitir uma mistura uniforme até que os vermes parem de se mover.
OBSERVAÇÃO: Os estoques de levamisol podem ser armazenados a -20 °C para armazenamento de longo prazo. Aqui, use a concentração mais alta de 1 - 3 mM do que a descrita na literatura23 de 0,2 - 0,25 mM de levamisol para obter rápida perda de mobilidade nos animais. Se os animais esfolarem por muito tempo na suspensão líquida, os padrões resultantes de dpERK nas gônadas podem ser variáveis (devido ao estresse ou falta de nutrição ou ambos). Padrões de coloração mais reprodutíveis foram alcançados com levamisol 1 - 3 mM para dissecção.
- Coloque duas agulhas de 25 G em duas seringas de 1 mL (o tamanho da seringa não importa, o calibre da agulha é crítico). Posicione uma seringa em cada mão (Figura 1).
- Sob um microscópio de dissecação, posicione cada agulha sob e sobre cada verme, conforme mostrado na Figura 1, e coloque um corte fino no verme próximo ao segundo bulbo faríngeo em um movimento semelhante a uma tesoura. Depois de um corte no verme, passe para o próximo animal até que todos os animais no prato tenham sido cortados pelo menos uma vez.
OBSERVAÇÃO: Lembre-se de que as etapas 1.8 a 1.9 são sensíveis ao tempo. Disseque todos os vermes no prato em menos de cinco minutos para um padrão dpERK reproduzível. Tempos de dissecção mais longos resultarão no desligamento do sinal dpERK, especialmente na Zona 1. Ajuste o número de vermes por rodada de dissecação (ou seja, 50 vermes vs. 150), se necessário, para permanecer no prazo estipulado.
- Caso uma gônada extrusada não seja visível durante a dissecção, não tente outro corte no mesmo animal. Normalmente, isso apenas corta o animal e não resulta na extrusão da gônada. Em vez disso, passe para o próximo animal. Vermes onde as gônadas não extrudam aparecerão como tal nas lâminas que serão feitas na seção 6 e podem ser ignorados durante a imagem
OBSERVAÇÃO: Em todas as etapas de dissecação e processamento, é importante ter em mente que a gônada permanecerá presa ao corpo/carcaça. Não force a gônada e o corpo separados com a agulha. Muitas vezes, uma ruptura aberrante no tecido gonadal na tentativa de separar a gônada do corpo pode resultar em sinal espúrio de anticorpos. O corpo/carcaça pode ser ignorado durante as etapas de imagem, e apenas a gônada pode ser fotografada. Além disso, às vezes as células intestinais também podem servir como controles internos / controles somáticos para o anticorpo que está sendo analisado.
Figura 1: Demonstração das posições das agulhas durante as dissecções. Esquerda: Fotografia de uma dissecação em andamento. Direita: Posições da agulha com referência ao verme. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
