O protocolo a seguir é um trecho de Prior et al, <a href="https://www.jove.com/video/57518/a-rapid-facile-pipeline-for-generating-genomic-point-mutants-c">A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins</a>, J. Vis. Exp. (2018).
PCR de verme único e genotipagem
<ol>
	<li>Após 1 a 2 dias de postura dos ovos, transfira o F1s para tampas de tubo de tira de PCR individuais contendo 7 μL de tampão de lise de verme usando um picareta de sem-fim (Tabela 1, Figura 1D, dia 4 - 5).</li>
	<li>Centrifugue os tubos de PCR na velocidade máxima por 1 min em temperatura ambiente para levar os animais ao fundo do tubo e congele os tubos a -80 °C por 1 h. 
	<classe forte = "nota"> OBSERVAÇÃO: Os vermes podem ser armazenados a -80 °C indefinidamente.</li>
	<li>Lisar minhocas congeladas em um termociclador usando o seguinte programa: 60 °C por 60 min, 95 °C por 15 min, 4 °C segurar.</li>
	<li>Configuração do mastermix de PCR conforme mostrado na Tabela 2.</li>
	<li>Adicione 21 μL de mastermix de PCR em tubos de PCR limpos e, em seguida, adicione 4 μL de lise de verme da etapa 3. Misture bem usando uma pipeta e execute o programa de PCR seguindo as diretrizes do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Purifique as reações de PCR usando um kit DNA Clean and Concentrate, seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Eluir o DNA adicionando 10 μL de água à coluna de rotação.</li>
	<li>Mastermix de enzimas de restrição de configuração, conforme mostrado na Tabela 3.</li>
	<li>Adicione 10 μL da mastermix de enzimas de restrição a cada reação de PCR limpa e incube por 1 a 2 h a 37 °C.</li>
	<li>Produtos de PCR digeridos separados em um gel de agarose a 1,5% executado a 120 V usando 1x tampão Tris-acetato-EDTA (TAE).</li>
</ol>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:839px;" width="839">
	<tbody>
		<tr altura = "19">
			<td height="19" style="height:20px;width:247px;">Água sem nuclease</td>
			<td style="width:180px;">Synthego Inc.</td>
			<td style="width:206px;">fornecido com o kit sgRNA EZ</td> kit
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr altura = "19">
			<td height="19" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Pág. 5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altura = "19">
			<td height="19" style="height:20px;">DNA Clean & Concentrator</td>
			<td>Pesquisa Zymo</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altura = "19">
			<td height="19" style="height:20px;">Kit de recuperação de DNA em gel Zymoclean</td>
			<td>Pesquisa Zymo</td>
			<td>D4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altura = "19">
			<td height="19" style="height:20px;">Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>Biolabs da Nova Inglaterra</td>
			<td>M0494L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altura = "19">
			<td height="19" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Pág. 2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altura = "19">
			<td altura="19" style="altura:20px;">MgCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altura = "19">
			<td height="19" style="height:20px;">NP-40</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Rolamento 74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altura = "19">
			<td height="19" style="height:20px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Científico</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altura = "19">
			<td height="19" style="height:20px;">Solução de descontaminação RNaseZap</td>
			<td>Fisher Científico</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pcr de verme único: um método para extrair e amplificar o dna genômico

Single Worm PCR: A Method to Extract and Amplify Genomic DNA

Fonte: Prior, H., et al. <a href="https://www.jove.com/video/57518/a-rapid-facile-pipeline-for-generating-genomic-point-mutants-c">Um pipeline rápido e fácil para gerar mutantes pontuais genômicos em C. elegans usando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9.</a>J. Vis. Exp.(2018).
Este vídeo descreve uma técnica para rastrear rapidamente um único nematóide em busca de um marcador genético por triagem de PCR. No protocolo de exemplo, examinamos a edição do genoma baseada em CRISPR.

<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/20133/20133fig1.jpg"> 
Figura 1. Engenharia CRISPR-Cas9 do locus C. eleganssod-1. (A) Ilustração esquemática representando a estrutura éxon-íntron do locus sod-1 em C. elegans. A barra vermelha indica a localização de G93 no éxon 3. O conjunto de pares de primers é indicado pelas setas vermelhas (F1-R1). (B) Alinhamento de sequência ...

PCR de verme único: um método para extrair e amplificar o DNA genômico

Fonte: Prior, H., et al. Um pipeline rápido e fácil para gerar mutantes pontuais genômicos em C. elegans usando CRISPR/Cas9 ...

- Para análise de PCR de verme único, permita que um verme hermafrodita se autofecunde e ponha ovos que produzirão descendentes geneticamente idênticos e, portanto, preservem uma cópia da cepa modificada. Em seguida, transfira o pai para um tubo contendo tampão de lise de vermes. Congele o tubo a 80 graus Celsius negativos para abrir a cutícula ou a camada externa. Aqueça a amostra a mais 60 graus Celsius para lisar as células vermes liberando as proteínas intracelulares junto com o DNA genômico da célula. Nessa temperatura, a proteinase K dentro do tampão degrada as proteínas, particularmente as nucleases que, de outra forma, destruiriam o DNA genômico. Em seguida, aumente a temperatura para 95 graus Celsius para inativar a enzima. Finalmente, adicione o lisado celular a um tubo com uma mistura mestre de PCR composta de tampão de reação, dNTPs, primers diretos e reversos para a região de interesse, taq polimerase e água, levando a reação a um volume final desejado. Para realizar a PCR, execute o programa termociclador apropriado que amplifica a região de DNA de interesse. No exemplo a seguir, veremos um procedimento de PCR para rastrear eventos de edição CRISPR-Cas9 no DNA genômico de vermes F1 únicos. - Após 1 a 2 dias de postura de ovos, use uma foto de minhoca para transferir os F1s para tampas de tubo de tira de PCR individuais contendo 7 microlitros de tampão de lise quente. Centrifugue os tubos de PCR na velocidade máxima e à temperatura ambiente durante um minuto para levar os animais ao fundo do tubo. Em seguida, congele os tubos a 80 graus Celsius negativos por uma hora. Em seguida, lise minhocas congeladas em um termociclador usando o seguinte programa. Em seguida, configure uma mistura principal de PCR conforme mostrado nesta tabela. Adicione 21 microlitros de mistura principal de PCR em tubos de PCR limpos. Em seguida, adicione 4 microlitros do tubo de lise do verme e misture bem pipetando. Em seguida, execute o programa de PCR seguindo as diretrizes do fabricante.

single-worm-pcr-a-method-to-extract-and-amplify-genomic-dna

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biology

Biologia

Caenorhabditis elegans (worm)

Caenorhabditis elegans (verme)

Basic Methods

Métodos Básicos

4.8K visualizações. - Para análise de PCR de verme único, permita que um verme hermafrodita se autofecunde e ponha ovos que produzirão descendentes geneticamente idênticos e, portanto, preservem uma cópia da cepa modificada. Em seguida, transfira o pai para um tubo contendo tampão de lise de vermes. Congele o tubo a 80 graus Celsius negativos para abrir a cutícula ou a camada externa. Aqueça a amostra a mais 60 graus Celsius para lisar as células vermes liberando as proteínas intracelulares junt...

Abstract

Protocol

<img title="figure-results-1" alt="figure-results-1" src="/files/ftp_upload/20133/20133fig1.jpg"> 
Figura 1. Engenharia CRISPR-Cas9 do locus C. eleganssod-1. (A) Ilustração esquemática representando a estrutura éxon-íntron do locus sod-1 em C. elegans. A barra vermelha indica a localização de G93 no éxon 3. O conjunto de pares de primers é indicado pelas setas vermelhas (F1-R1). (B) Alinhamento de sequência ...

PCR de verme único: um método para extrair e amplificar o DNA genômico

Neste artigo

Resumo

Protocolo

Resultados

Materiais

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Artigos relacionados

Nome	Empresa	Número de catálogo
Água sem nuclease	Synthego Inc.	fornecido com o kit sgRNA EZ
KCl	sigma	Pág. 5405
DNA Clean & Concentrator	Pesquisa Zymo	D4004
Kit de recuperação de DNA em gel Zymoclean	Pesquisa Zymo	D4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	Biolabs da Nova Inglaterra	M0494L
Proteinase K	sigma	Pág. 2308
MgCl2	sigma	M2393
NP-40	sigma	Rolamento 74385
Tween-20	Fisher Científico	BP337-100
Solução de descontaminação RNaseZap	Fisher Científico	AM9780