PCR de verme único: um método para extrair e amplificar o DNA genômico

Neste artigo

Resumo

Fonte: Prior, H., et al. Um pipeline rápido e fácil para gerar mutantes pontuais genômicos em C. elegans usando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9.J. Vis. Exp.(2018).

Este vídeo descreve uma técnica para rastrear rapidamente um único nematóide em busca de um marcador genético por triagem de PCR. No protocolo de exemplo, examinamos a edição do genoma baseada em CRISPR.

Protocolo

O protocolo a seguir é um trecho de Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

PCR de verme único e genotipagem

Após 1 a 2 dias de postura dos ovos, transfira o F₁s para tampas de tubo de tira de PCR individuais contendo 7 μL de tampão de lise de verme usando um picareta de sem-fim (Tabela 1, Figura 1D, dia 4 - 5).
Centrifugue os tubos de PCR na velocidade máxima por 1 min em temperatura ambiente para levar os animais ao fundo do tubo e congele os tubos a -80 °C por 1 h.
OBSERVAÇÃO: Os vermes podem ser armazenados a -80 °C indefinidamente.
Lisar minhocas congeladas em um termociclador usando o seguinte programa: 60 °C por 60 min, 95 °C por 15 min, 4 °C segurar.
Configuração do mastermix de PCR conforme mostrado na Tabela 2.
Adicione 21 μL de mastermix de PCR em tubos de PCR limpos e, em seguida, adicione 4 μL de lise de verme da etapa 3. Misture bem usando uma pipeta e execute o programa de PCR seguindo as diretrizes do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
Purifique as reações de PCR usando um kit DNA Clean and Concentrate, seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Eluir o DNA adicionando 10 μL de água à coluna de rotação.
Mastermix de enzimas de restrição de configuração, conforme mostrado na Tabela 3.
Adicione 10 μL da mastermix de enzimas de restrição a cada reação de PCR limpa e incube por 1 a 2 h a 37 °C.
Produtos de PCR digeridos separados em um gel de agarose a 1,5% executado a 120 V usando 1x tampão Tris-acetato-EDTA (TAE).

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Resultados

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Figura 1. Engenharia CRISPR-Cas9 do locus C. eleganssod-1. (A) Ilustração esquemática representando a estrutura éxon-íntron do locus sod-1 em C. elegans. A barra vermelha indica a localização de G93 no éxon 3. O conjunto de pares de primers é indicado pelas setas vermelhas (F1-R1). (B) Alinhamento de sequência ...