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Abstract

Fonte: Escorcia, W., et al. Quantificação da Abundância de Lipídios e Avaliação da Distribuição de Lipídios em Caenorhabditis elegans por Coloração de Vermelho do Nilo e Vermelho de Óleo O. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve um protocolo para corar lipídios em vermes inteiros e fixos usando corante vermelho do Nilo. Para visualizar especificamente os lipídios neutros no núcleo das gotículas lipídicas, imagine os espectros de emissão verde do C. elegans corado.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Escorcia et al, Quantificação da Abundância de Lipídios e Avaliação da Distribuição de Lipídios em Caenorhabditis elegans por Nile Red e Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

1. Coloração de lipídios com vermelho do Nilo (NR)

1. Preparação de 5 mg/ml de solução-mãe de NR
   1. Em um frasco de 500 mL, adicione 100 mg de pó de NR a 200 mL de acetona 100%.
   2. Cubra a garrafa com papel alumínio para evitar qualquer exposição à luz.
   3. Antes de usar, agite a solução por 2 h no escuro.
   4. Para uso a longo prazo, armazene a solução estoque NR em um frasco hermeticamente fechado sem qualquer exposição à luz. Dimensione a solução de estoque NR de acordo com as necessidades de pesquisa. Certifique-se de que a mesma solução padrão seja usada em experimentos de coloração NR para obter resultados consistentes de coloração e imagem.
2. Preparação da solução de trabalho NR
   1. Para cada 1 mL de isopropanol a 40% (v / v), adicione 6 μL de solução estoque de NR.
   2. Prepare 600 μL de solução de trabalho NR para cada amostra.
      OBSERVAÇÃO: Faça uma solução de trabalho NR fresca antes da coloração. Dependendo das necessidades da solução estoque NR, use um tubo cônico graduado de 15 mL ou 50 mL.
3. Preparação de vermes para coloração lipídica NR
   1. Cultive vermes até o estágio inicial de L4 a 20 ° C em meio de crescimento de nematóides (NGM) semeado com E. coli OP50 de log tardio.
   2. Lave os vermes da placa com 1 mL de 1x solução salina tamponada com fosfato + solução de Triton X-100 (PBST) a 0,01% e coloque a suspensão do verme em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Centrifugue os vermes a 560 x g por 1 min. Remova o sobrenadante e repita esta etapa até que a E. coli seja removida da suspensão.
   4. Adicione 100 μL de isopropanol a 40% ao pellet de minhoca e incube-o à temperatura ambiente por 3 min.
   5. Centrifugue os vermes a 560 x g por 1 min e remova o sobrenadante sem interromper o pellet do verme.
      OBSERVAÇÃO: Use volumes maiores de PBST para lavar os vermes das placas se estiver usando placas maiores ou manchando mais vermes por placa. Não lave os vermes em PBST mais de 15 minutos antes da fixação da amostra. Faça lavagens adicionais se o sobrenadante não estiver livre de bactérias. Realize a incubação em isopropanol a 40% usando um nutador ou balancim. Sempre monitore os tubos para garantir que a agitação total da amostra esteja ocorrendo.
4. Coloração lipídica com NR
   1. No escuro, adicione 600 μL de solução de trabalho NR a cada amostra. Inverta os tubos três vezes e misture totalmente os vermes na solução NR.
   2. Gire a amostra no escuro à temperatura ambiente por 2 h.
   3. Após a incubação, centrifugue os vermes a 560 x g por 1 min e remova o sobrenadante.
   4. Adicione 600 μL de PBST e incube as amostras no escuro por 30 min para remover o excesso de mancha NR.
   5. Centrifugue as amostras a 560 x g por 1 min e remova tudo, exceto aproximadamente 50 μL de sobrenadante.
      OBSERVAÇÃO: A incubação NR não requer agitação. O assentamento de vermes é comum durante esta etapa.
5. Preparação de lâminas para imagens microscópicas
   1. Ressuspenda o pellet de minhoca no sobrenadante restante.
   2. Coloque 5 μL de suspensão sem-fim em uma lâmina de microscópio e coloque uma lamínula com cuidado para evitar prender bolhas de ar.
   3. Sele a lamínula com esmalte antes de criar imagens de vermes.
   4. Prepare apenas alguns slides de cada vez. Isso garantirá que a imagem NR permaneça constante em todas as amostras. A qualidade das imagens coradas com NR diminui após 6 h. Gotículas lipídicas discretas são difíceis de observar e a fluorescência de fundo aumenta, o que interfere na detecção do sinal NR.
6. Imagem de vermes corados com NR
   1. Visualize as minhocas com ampliação de 5X para capturar vários animais por campo de visão.
   2. Mude para ampliação de 10X para melhor quantificação de vermes individuais.
   3. Use o canal FITC/GFP para obter imagens de vermes corados com NR e tente diferentes tempos de exposição para determinar as condições ideais para quantificação.
   4. Salve arquivos no formato TIF para evitar a perda de dados devido à compactação.
      OBSERVAÇÃO: Os tempos de exposição típicos variam de 100 a 1000 ms. Tendo um tempo de exposição ideal, use-o para todas as amostras para manter a consistência da imagem.

Materials

Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator