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Este protocolo é um trecho de Germany et al, Isolamento de populações específicas de neurônios de lombriga Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.(2019).
1. Preparação e coleta de vermes envelhecidos para isolamento celular
NOTA: Explicado abaixo está o isolamento de neurônios colinérgicos da cepa transgênica unc-17::GFP (OH13083) obtida do repositório de cepas do Caenorhabditis Genetics Center (CGC) da Universidade de Minnesota. É imperativo manter condições estéreis para evitar a contaminação por fungos ou bactérias.
- Prepare e sincronize os vermes através do método de branqueamento, conforme descrito por T. Stiernagle. Para experimentos de envelhecimento, placas de vermes em placas de meio de crescimento de nematóides (NGM) contendo 25 μM de solução aquosa de fluorodesoxiuridina (FuDR) para reduzir a produção de ovos e interromper a eclosão dos ovos. Inspecione as placas de ágar regularmente para evitar contaminação ou eclosão de ovos, pois isso causará resultados não confiáveis.
OBSERVAÇÃO: Para células unc-17::GFP, normalmente três placas NGM de 100 mm x 15 mm são usadas para isolar uma quantidade suficiente de células de interesse.
- Colete vermes e prepare tampões para o isolamento celular.
- Colete os vermes em um tubo cônico de 15 mL. Lave os vermes da placa com 1,5 mL de tampão M9 (1 mM MgSO4, 85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4 · 7H2O, 22 mM KH2PO, pH 7,0) e centrifugue por 5 min a 1.600 x g. Descarte o sobrenadante e lave os vermes com 1 mL de tampão M9. Repita a centrifugação e lave por um total de cinco vezes para remover o máximo possível de contaminação por E. coli.
OBSERVAÇÃO: A adição de antibióticos (50 μg/mL), como a ampicilina, nesta etapa pode ajudar a reduzir a contaminação bacteriana.
- Para duas amostras, prepare 2 mL de tampão de lise dodecil sulfato-ditiotreitol de sódio (SDS-DTT): 200 mM DTT, 0,25% (p / v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) e 3% (p / v) sacarose.
- Prepare 15 mL de tampão de isolamento (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES [pH 7,3]) e armazene-o em gelo.
OBSERVAÇÃO: Tanto o tampão de lise SDS-DTT quanto o tampão de isolamento devem ser renovados antes de cada experimento.
- Ruptura da cutícula e isolamento de célula única
- Centrifugar os animais coletados na etapa 1.2.1 por 5 min a 1.600 x g. Remova todos os sobrenadantes e suspenda os vermes em 1 mL de meio M9 e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Vermes de pellets com centrifugação a 1.600 x g por 5 min.
- Adicione 200 μL de tampão de lise SDS-DTT aos vermes e incube por 5 min em temperatura ambiente (RT). Os vermes devem parecer "enrugados" ao longo do corpo se vistos ao microscópio de luz.
OBSERVAÇÃO: A exposição prolongada ao tampão de lise SDS-DTT pode resultar na morte de vermes, que pode ser monitorada pela observação de vermes. Os vermes mortos se alongam e não se enrolam.
- Adicione 800 μL de tampão de isolamento gelado e misture sacudindo suavemente o tubo.
- Vermes de pellets por 1 min a 13.000 x g a 4 ° C, remova o sobrenadante e lave com 1 mL de tampão de isolamento.
- Repita a etapa 1.3.5 por um total de cinco vezes, removendo cuidadosamente o buffer de isolamento a cada vez.
- Adicione 100 μL de mistura de protease de Streptomyces griseus (15 mg / mL) (Tabela de Materiais) dissolvida em tampão de isolamento ao pellet e incube por 10 a 15 min em RT.
OBSERVAÇÃO: Tal como acontece com o tampão de lise SDS-DTT, a digestão prolongada da protease pode resultar em clivagem excessiva de proteínas ao longo da membrana plasmática, impedindo o isolamento da GFP exposta à superfície por meio de esferas magnéticas.
- Durante a incubação com mistura de protease, aplique a interrupção mecânica pipetando as amostras para cima e para baixo contra o fundo do tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com uma ponta de micropipeta de 200 μL por ~ 60 a 70 vezes. Mantenha a ponta da pipeta contra a parede do tubo da microcentrífuga com pressão constante para dissociar adequadamente as células.
- Para determinar o estágio da digestão, remova um pequeno volume (~ 1−5 μL) da mistura de digestão, coloque-a em uma lâmina de vidro e inspecione-a usando um microscópio de cultura de tecidos. Após 5 a 7 minutos de incubação, os fragmentos de vermes devem ter cutícula visivelmente reduzida e uma pasta de células será facilmente visível.
- Reação de interrupção com 900 μL de meio L-15 de Leibovitz frio comercialmente disponível suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e penicilina-estreptomicina (concentração final a 50 U/mL de penicilina e 50 μg/mL de estreptomicina).
- Fragmentos e células isolados de pellets por centrifugação por 5 min a 10.000 x g a 4 ° C. Lave as células peletizadas com 1 mL de meio suplementado com L-15 frio mais duas vezes para garantir que o excesso de detritos e cutícula seja removido.
- Ressuspenda as células peletizadas em 1 mL de meio suplementado com L-15 e deixe no gelo por 30 min. Leve a camada superior, aproximadamente 700−800 μL, para um tubo de microcentrífuga. Esta camada contém células sem detritos celulares e será usada no isolamento subsequente de células de interesse.
- Seguindo as instruções do fabricante, use um contador de células automatizado ou hemocitômetro para medir a densidade celular de 10 a 25 μL de células isoladas.