$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo é um trecho de Clarke et al, Manipulação de Ploidia em Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).
As cepas tetraplóides podem ser validadas contando o número de cromossomos em seus oócitos não fertilizados. A microscopia fluorescente pode ser usada para rastrear o número de pares de cromossomos em oócitos diplóides não fertilizados (antes das divisões meióticas), se a cepa tiver um marcador fluorescente para cromossomos. Na ausência de marcadores cromossômicos fluorescentes, os nematóides tetraplóides podem ser rastreados fixando os nematóides e colorindo com um corante de DNA; veja abaixo um protocolo para fixação de etanol e coloração de dicloridrato de 4′,6-Diamidina-2′-fenilindol (DAPI) de animais inteiros.
Coloração DAPI de animais inteiros
NOTA: As cepas tetraplóides que carregam 12 pares de cromossomos conectados podem ser validadas pela coloração DAPI desses animais e contando o número de corpos DAPI em seus oócitos não fertilizados.
- Coloque 5 a 10 μL de tampão M9 em uma lâmina de microscópio e, em seguida, transfira de 6 a 10 nematóides para a gota.
- Sob um microscópio de dissecação, retire a maior parte do M9 da gota sem remover os nematóides com um pano de limpeza sem fiapos. Em seguida, adicione imediatamente uma gota de 10 μL de etanol a 90% nas minhocas. Deixe as minhocas secarem completamente, mas não por mais do que alguns segundos.
- Assim que o etanol evaporar (isso pode ser visto como acontece sob o microscópio de dissecação), adicione mais 10 μL de etanol a 90% nos vermes.
- Repita a etapa 3.1.3 mais três vezes.
- Uma vez que a última gota de etanol tenha evaporado, adicione 6 μL de DAPI ou corante Hoechst na concentração final recomendada no meio de montagem de escolha (por exemplo, uma diluição de 1:1.000 de uma concentração de estoque de DAPI de 2 ng/μL em M9). Para armazenamento a longo prazo das lâminas, pode-se usar p-fenilenodiamina a 0,5% dissolvida em Tris-HCl 20 mM, pH 8,8, em glicerol a 90% como solução antidesbotamento, em vez de apenas M9.
- Cubra as minhocas na lâmina com uma lamínula e sele as bordas da lamínula com esmalte. Pontue em um microscópio de fluorescência (etapa 3.1.7) pelo menos 10 minutos após adicionar a lamínula. As lâminas sem antidesbotamento podem ser armazenadas por alguns dias a 4 °C antes de serem marcadas, mas a qualidade da fluorescência começa a diminuir após alguns dias.
- Usando um microscópio fluorescente com ampliação de 100X, marque o número de corpos DAPI únicos (presumivelmente pares de cromossomos únicos) no oócito não fertilizado mais maduro, que é imediatamente adjacente à espermateca e ainda não entrou na espermateca ou no útero.
- Para pontuar corpos DAPI individuais dentro de um núcleo de oócito, use o foco fino do microscópio para se mover lentamente do topo do núcleo do oócito para o fundo durante a contagem. Em seguida, reconte o mesmo núcleo enquanto move o foco na direção oposta (ou seja, de baixo para cima do núcleo) para confirmar o número contado de corpos DAPI.
- Marque o oócito não fertilizado mais maduro em cada uma das duas gônadas em pelo menos dez hermafroditas por cepa de Lon estável. Os oócitos do tipo selvagem têm 6 corpos DAPI em média, 5 pares de autossomos e o par de cromossomos sexuais. A presença de 12 corpos DAPI no oócito de cepas estáveis de Lon indica que os animais desta linhagem são tetraplóides parciais (4 conjuntos de autossomos, 3 cromossomos X) ou completos (4 conjuntos de autossomos, 4 cromossomos X).
- Calcule o número médio de corpos DAPI observados em múltiplos (pelo menos 10) oócitos por cepa. Alguns pares de cromossomos estarão se tocando ou bem em cima um do outro, então o número de corpos DAPI em um oócito geralmente é menor do que o número real de pares de cromossomos.
- (Opcional) Valide ainda mais as cepas Lon estáveis onde o número médio de corpos DAPI é 12 para testar se são tetraplóides completos (4A, 4X) ou parciais (4A, 3X) por coloração de imunofluorescência contra proteínas do eixo cromossômico, como HTP-3. Essa coloração distinguirá os pares de cromossomos mostrando um padrão cruciforme de cromossomos únicos não conectados presentes no tetraplóide parcial.