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Abstract

Fonte: Kudumala, S., et al. Paralisia induzida por natação para avaliar a sinalização de dopamina em Caenorhabditis elegans. J. Vis.(2019).

Aqui, apresentamos um ensaio para medir SWIP, um fenótipo comportamental de C. elegans que ocorre durante movimentos vigorosos como natação. O protocolo de exemplo discute abordagens de análise manual e automatizada.

Protocol

O protocolo a seguir é um trecho de Kudumala et al, Paralisia induzida por natação para avaliar a sinalização de dopamina em Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.(2019).

SWIP

NOTA: Descrevemos o método manual de avaliação do SWIP em vermes do tipo selvagem tratados com AMPH. Também discutimos brevemente o rastreamento de vermes e uma análise mais aprofundada da cinética do verme usando um rastreador automatizado de vermes e um software de rastreamento que foram descritos anteriormente por Hardaway et al.

1. Método manual para testar SWIP
   1. Alíquota de 40 μL de solução de sacarose a 200 mOsm/L com ou sem AMPH 0,5 mM em uma placa de ponto de vidro. Sob o estereoscópio, pegue de 8 a 10 vermes do estágio L4 tardio com um picareta de cílios ou platina e mergulhe a palheta na placa que contém a solução até que os vermes saiam da picareta e nadem para dentro da solução. Observe o número de vermes coletados no poço, inicie o cronômetro, observe e registre o número de vermes exibindo SWIP em cada minuto.
   2. Copie os dados brutos em uma planilha e calcule a porcentagem de vermes paralisados dividindo o número de vermes paralisados a cada minuto pelo número total de vermes testados ao longo do ensaio e multiplique por 100. Copie os valores percentuais em qualquer software gráfico e estatístico e plote os dados com valores percentuais no eixo Y e tempo no eixo X usando o formato de gráfico XY.
   3. Realize ANOVA de duas vias seguida de análise post-hoc (por exemplo, pós-teste de Bonferroni) para testar a significância estatística entre os grupos controle, AMPH e tempo de tratamento.
2. Análise automatizada de SWIP
   1. Execute análises automatizadas em um único worm por vez. O protocolo para configurar a câmera, o software rastreador de worms e o script para executar a análise do software de rastreamento são descritos em detalhes em Hardaway et al.
   2. Resumidamente, coloque um único hermafrodita de estágio L4 tardio em uma placa de vidro utilizando um palito de cílios, conforme descrito no método manual na seção 1.1.2. Grave vídeos de natação de um verme de cada vez e use o software rastreador de minhocas para calcular a frequência das curvas do corpo.
   3. Siga o script fornecido com o software de rastreamento para obter a frequência de debulhamento de vermes e gerar mapas de calor a partir dos dados de debulhamento de vermes.

Materials

Amphetamine	Sigma	51-63-8  
Depression glass spot plate	Corning	Corning, Inc. 722085
Eye lash
Graphing and statistical software	Prism		Graphpad 5
Osmometer	Advanced Instruments, Inc	Model 3320
Spreadsheet	MS office		Microsoft Excel
Stereo Microscope	Zeiss	Model tlb3. 1 stemi2000
Sucrose	Sigma-Aldrich	RB=S5016
Superglue	Loctite	1647358 .14 oz.
SwimR sofware	10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2	Worm Tracker 2.0	www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software	Virtualdub	http://www.virtualdub.org/