Plaqueamento de RNAi para alimentação de C. elegans: uma técnica para induzir a expressão de dsRNA alvo em E. coli

Resumo

Fonte: Kolundzic, E., et al. Aplicação de RNAi e expressão de fator de transcrição induzida por choque térmico para reprogramar células germinativas para neurônios em C. elegans. J. Vis.(2018).

Este vídeo descreve os princípios por trás do tratamento com RNAi em C. elegans e demonstra um protocolo para derrubar o lin-35 em uma cepa de verme transgênico.

Protocolo

Este protocolo foi extraído de Kolundzic, et al, Aplicação de RNAi e expressão do fator de transcrição induzido por choque térmico para reprogramar células germinativas para neurônios em C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Preparação da solução
   1. Placas de ágar NGM (1 L)
      1. Adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de meio peptonada (por exemplo, Bacto-Peptone) e 20 g de ágar. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de colesterol (5 mg / mL em estoque de EtOH a 95%), 1 mL de 1 M MgS....

Resultados

Figura 1: Fenótipo Pvul causado por RNAi contra lin-53. (Topo) Imagem DIC de vermes da progênie F1 em estágio L4 / adulto jovem derivados de mães tratadas com controle ou lin-53 RNAi. Barras de escala = 20 μm. (Abaixo) Animais tratados com lin-53 RNAi exibem o fenótipo da vulva saliente (pvul) (pontas de setas pretas). O fenótipo pvul confirma que o RNAi contra lin.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Produtos químicos
Agar-Agar, Kobe I	Roth	Rolamento 5210.1
bactopeptona	A. Hartenstein GmbH	211 677	Mídia Peptonada
Extrato de levedura	Aplicação	A1552,0100
Anfotericina B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biociências	208290
Colesterol	Roth	8866.2
Gelatina	Roth	Rolamento 4275.3
IPTG	sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25.163.364
Na2HPO4	Roth	Pág. 030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicilina	Roth	634412
Tetraciclina	Roth	2371.2
Incubadoras
Incubadora	Sanyo MIR-5	5534210	para manutenção de cepas de vermes a 15 °C ou 25 °C
Microscópios
Estereomicroscópio	SMZ745	Nikon
Cepas bacterianas
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(LISOGÊNIO DE3: lavUV5promotor -T7 polimerase) (polimerase T7 induzível por IPTG) (RNAseIII menos).
Escherichia coli OP50			Cepa de E. coli auxotrófica de uracila
Cepas de vermes
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derivado de OH9846 por 4x mais retrocruzamento com N2
RNAi Clones
LIN-53	FonteBiociência	ID I-4D14	Biblioteca Ahringer 16B07 ChromI, K07A1.12
vetor vazio: L4440	Addgene	#1654