Alimentação de RNAi em cultura líquida: um método de alto rendimento para derrubar a expressão gênica em C. elegans

Resumo

Fonte: Groh, N. et al. Métodos para Estudar Mudanças na Agregação Proteica Inerente com a Idade em Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp.(2017).

RNAi é uma poderosa ferramenta genética disponível para pesquisadores de C. elegans. Este vídeo apresenta um método para tratar mais vermes com RNAi do que com alimentação em placas, utilizando condições de cultura líquida.

Protocolo

Este protocolo é um trecho de Groh et al, Métodos para estudar mudanças na agregação de proteínas inerentes com a idade em Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Cultura líquida de animais sem gônadas para coleta de animais jovens e idosos submetidos a RNAi direcionado a um gene de interesse

NOTA: A resposta de alguns genes ao RNAi pode ser dependente da temperatura, conforme descrito anteriormente. Como alternativa ao RNAi, um gene mutante pode ser incorporado ao fundo gon-2 (-).

1. Preparação de bactérias para cultura líquida
   1. Preparar as bactérias OP50 e RNAi (bactérias produtoras do dsRNA desejado e bactérias com o vector vazio como controlo) inoculando 4 L de meio LB com 12 ml da respetiva cultura bacteriana (adicionar uma concentração final de 50 μg/ml de carbenicilina e 1 mM de IPTG às culturas bacterianas de RNAi) e incubá-las a 37 °C durante a noite a 180 rpm.
   2. No dia seguinte, colha as culturas a 6.700 x g por 10 min a 4 ° C. Remova os sobrenadantes e ressuspenda cada pellet em 60 mL de meio basal S gelado (100 mM de NaCl, 50 mM de fosfato de potássio pH 6, mantido em gelo). Manter os três grânulos ressuspensos (OP50, bactérias de ARN de controlo e bactérias de RNAi para o gene de interesse) a 4 °C até ao passo 1.2.
      OBSERVAÇÃO: Os vermes podem ser cultivados em RNAi a partir do estágio L1 ou para evitar defeitos de desenvolvimento do último estágio larval L4 (consulte a etapa 1.2).
2. Cultura líquida para tratamento com RNAi a partir do último estágio larval L4
   1. Adicionar 200 mL de meio basal S em um frasco de cultura de Fernbach (capacidade de 2.800 mL). Para um volume de cultura final de 300 mL (ver 1.2.2.4), adicione 10 mM de citrato de potássio, pH 6, 3 mL de solução de metais traços (5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 2,5 mM de FeSO₄, 1 mM de MnCl₂, 1 mM de ZnSO₄, 0,1 mM de CuSO₄), 3 mM de MgSO₄, 3 mM de CaCl₂, 100 ng/mL de carbendazime e 5 μg/mL de colesterol). Feche o frasco com uma tampa de rosca de membrana. Consulte a Tabela 1 para obter receitas de tampões.
   2. Retire os L1s de 25 °C e transfira-os para tubos de 15 mL. Centrifugue a 1.900 x g por 3 min, remova o sobrenadante e conte os L1s por 2 μL. Adicione 500.000 L1s ao frasco de cultura de Fernbach preparado na etapa anterior.
   3. Adicione OP50 (da etapa 1.1) proporcionalmente ao número de vermes. Por exemplo, para 500.000 minhocas, adicione 60 mL OP50.
   4. Cultura completa de vermes com S basal para elevar o volume total para 300 mL. Incubar a cultura de minhocas até ao estádio L4 a 25 °C numa estufa agitada de 150 rpm.
   5. No dia seguinte, os vermes devem ser do tamanho de L4s do tipo selvagem. Para mudar de OP50 para RNAi Lave os L4s com M9 para remover as bactérias OP50 residuais: centrifugue a 1900 x g durante 3 min, retire o sobrenadante e transfira todos os L4s para um tubo de 50 ml. Contar os L4s por 5 μL (pelo menos nove vezes). Duas vezes 50.000 L4s são necessários para a coleta de vermes jovens e duas vezes 100.000 L4s são necessários para a coleta de vermes envelhecidos.
   6. Preparar quatro balões de cultura de Fernbach como descrito no ponto 1.2.2.1. Adicionar também uma concentração final de 50 μg/ml de carbenicilina e 1 mM de IPTG a cada balão.
   7. Adicione bactérias de RNAi de controle e bactérias de RNAi para o gene de interesse (da etapa 1.1) proporcionalmente ao número de vermes: Adicione 7 mL das respectivas bactérias por frasco para vermes jovens e 14 mL por frasco para os vermes envelhecidos.
   8. Adicione 50.000 minhocas por frasco para a coleção de minhocas jovens e 100.000 minhocas por frasco para a coleção de minhocas envelhecidas e complete as culturas com S basal para encher até 300 mL. Incubar as culturas de minhocas (quatro no total) a 25 °C e 150 rpm.

2. Manutenção de culturas líquidas de C. elegans

1. Recolher periodicamente uma alíquota de cada cultura líquida e colocá-la numa lâmina de vidro (em alternativa, numa placa de ágar) para verificar se não existem contaminações. Usando um microscópio de dissecação, verifique os níveis de alimento bacteriano na cultura, especialmente durante a fase de crescimento. Preparar previamente 2 L de culturas de bactérias de controlo do RNAi e de bactérias do RNAi para o gene de interesse, conforme descrito no passo 1.1. Adicione-os às culturas líquidas de C. elegans, se necessário, e mantenha o restante a 4 °C.
2. Verifique periodicamente se os animais são estéreis. A maioria dos animais não terá gônada. Dependendo da penetrância da mutação gon-2, alguns podem ter estruturas gonadais abortadas, mas nenhum animal com ovos deve ser observado.

Solução de estoque	quantidade	Concentração final	Comentários/Descrição
S basal (Para 500 mL: 5,9 g NaCl, 50 mL 1 M Fosfato de potássio pH 6)	200 mL		1 M Fosfato de potássio pH 6: Para 1 L: 129 g KH2PO4 monobásico, 52 g de K2HPO4 dibásico anidro
1 M Citrato de potássio pH 6 (Para 400 mL: 13,1 g de ácido cítrico monohidratado, 134,4 g de citrato de potássio monohidratado)	3 mL	10 mM
Solução de metais traços (Para 1 L: 1,86 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g de MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g de ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g de CuSO4 · 5 H2O)	3 mL		Armazenar a solução de estoque no escuro a 4 °C
1 M MgSO4 (Para 500 mL: 123,3 g)	900 μL	3 mM
1 M CaCl2 (Para 500 mL: 73,5 g)	900 μL	3 mM
200 μg/mL Carbendazim (Para 50 mL: 10 mg em metanol)	150 μL	100 ng/mL
5 mg/mL Colesterol (Para 100 mL: 0,5 g em etanol)	300 μL	5 μg/ml

Tabela 1.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Frasco de cultura Fernbach	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacidade 2.800 ml, com 3 travessões defletores	Sim
Tampa de rosca de membrana	Schott	1E+06	GL45	Sim
Misturador de nutação	VWR	444-0148		Sim
Funil de separação	Nalgene	4300-1000	Capacidade 1.000 ml	Não
Seringa de 1 ml	BD Plastipak	3E+05		Não
Agulha cinza, 27 G x 1/2 ", 0,4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05		Não
Filtros de membrana 0,025 μM	Millipore	VSWP04700		Não
Faixa de pH	Machery-Nagel	Rolamento 92110	pH Fixo 0-14	Não
Coquetel de inibidores de protease	Roche	5E+09	Comprimidos completos sem Mini EDTA	Não
Octoxinol-9	Aplicativo	A1388	Tritão X-100	Não
Ácido 4-morfolinaetanossulfônico (MES)	Sigma-Aldrich	M1317		Não
Nonilfenilpolietilenoglicol	Aplicativo	A1694	Nonidet P40 (NP40)	Não
DNaseI	Roche	5E+09	recombinante, livre de RNase	Não
RNase	Promega	Rolamento A7973	solução	Não
Coloração de blot proteico total	Thermofisher	S11791	Coloração de mancha de proteína Sypro Ruby	Não
Coloração de gel de proteína total	Thermofisher	S12001	Coloração de gel de proteína Sypro Ruby	Não
TCEP (cloridrato de tris (2-carboxietil) fosfina)	Serva	Rolamento 36970		Não
Iodoacetamida	Serva	Rolamento 26710		Não
Bicarbonato de amónio	Sigma-Aldrich	Rolamento 9830		Não
Tripsina modificada de grau de sequenciamento	Promega	V5111		Não
Etiquetas isobáricas para quantificação relativa e absoluta	Sciex	4E+06	Kit multiplex de reagentes iTRAQ	Não
Centrífuga Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05		Sim
Ultracentrífuga Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05		Não
Centrífuga 5424R	Eppendorf	5E+09		Sim
Centrífuga 5702	Eppendorf	6E+09		Sim
Centrífuga Megafuge 40R	Thermo Científico	8E+07		Não
Concentrador Plus	Eppendorf	5E+09	Evaporador centrífugo	Não
Estereomicroscópio fluorescente M165 FC	Leica		Com objetiva Planapo 2.0x	Não
Microscópio de dissecção	Leica		Leica S6E	Sim
Microscópio de alta ampliação Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		Com objetiva PlanAPOCHROMAT 20x e Zeiss Axio Cam MRm	Não
software				Não
Software de análise de imagens	ImagemJ			Não
Análise de dados de espectrometria de massa	Prospector de Proteínas		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	Não
Cepas de E.coli
OP50	CGC
Bactérias de RNAi
L4440	Biblioteca de RNAi de Julie Ahringer
Mutantes de C. elegans
CF2253	CGC, nome da cepa: EJ1158		Genótipo: gon-2 (q388)
Transgênicos de C. elegans
DCD214	Laboratório de Della David na DZNE Tübingen		Genótipo: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215	Laboratório de Della David na DZNE Tübingen		Genótipo: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]