Ensaio de olfatômetro de quatro vias: um método para avaliar as respostas de odorantes em Drosophila

Resumo

Fonte: Lin, C.C., et al. Comportamentos olfativos testados por rastreamento computacional de Drosophila em um olfatômetro de quatro quadrantes. J. Vis. Exp. (2016).

As moscas-das-frutas têm um sistema olfativo complexo, podem discriminar centenas de odores e usar seu olfato para direcionar decisões comportamentais. Este vídeo descreve o ensaio do olfatômetro de quatro vias, um método para estudar as respostas comportamentais olfativas em moscas. O clipe de protocolo apresentado mostra como lidar com moscas de teste e quais são as etapas críticas durante a execução do ensaio.

Protocolo

Este protocolo é um trecho de Lin et al., Comportamentos olfativos ensaiados por rastreamento de computador de Drosophila em um olfatômetro de quatro quadrantes, J. Vis. Exp. (2016).

1. Respostas comportamentais a odores atraentes e repelentes

1. Ligue o controlador de temperatura e ajuste-o para 25 °C.
2. Conecte as câmaras de odor (controle e teste de odor
3. Verifique a vazão em cada quadrante usando o medidor de fluxo de ar para certificar-se de que as correntes de ar de controle e odor sejam iguais a 100 ml/min.
4. Limpe a arena de mosca de PTFE e as placas de vidro com etanol a 70% 2-3 vezes e deixe-as secar completamente ao ar (~3-4 min).
5. Fixe as placas de vidro na arena com grampos.
6. Transfira moscas sem anestesia com CO₂ para a arena através do orifício em uma das placas de vidro. Após a transferência, coloque uma malha circular no orifício para evitar que as moscas escapem.
   OBSERVAÇÃO: A anestesia com CO₂ demonstrou afetar o comportamento da Drosophila e não deve ser usada dentro de 24 horas após um experimento comportamental.
7. Coloque a arena com moscas na câmara à prova de luz, conecte os quatro fluxos de ar de controle conectando a tubulação conectada ao encaixe push-to-connect na caixa de comportamento aos cantos da arena, feche a porta da câmara e espere 10-15 min para deixar as moscas se aclimatarem ao novo ambiente. Se possível, desligue as luzes da sala onde os experimentos são realizados, para evitar possíveis vazamentos mínimos de luz que possam influenciar o resultado experimental.
8. Execute um experimento de controle de 5 a 10 minutos, no qual as moscas são expostas a 4 fluxos de ar de controle.
9. Analise os dados imediatamente (consulte a seção Análise de dados abaixo) para garantir que as moscas estejam distribuídas uniformemente na arena e que o Índice de Atração esteja próximo de 0. Esta etapa é essencial, pois verifica se não há fontes descontroladas de preferência ou evitação dentro da arena (por exemplo, vazamento de luz do lado de fora, distribuição desigual de temperatura, arena irregular, contaminação por odores, etc.). Se as moscas estiverem distribuídas de forma desigual ou sua atividade locomotora for baixa, descarte as moscas, limpe a arena novamente (Etapa 1.4) e use um novo lote de moscas para repetir o experimento.
10. Conecte a câmara de odor de teste à configuração ligando as válvulas de 3 vias ou reconectando os tubos conectores.
11. Execute o experimento de teste por 5 a 10 minutos e analise os dados conforme discutido na seção 2 abaixo (Figura 1). Gravações com mais de 20 minutos podem resultar em arquivos de dados que podem ser difíceis de processar computacionalmente. Se forem desejadas gravações experimentais mais longas, pare e reinicie rapidamente o programa de rastreamento. Isso resulta em um intervalo de ~ 10 segundos entre as gravações experimentais.
12. Descarte as moscas.
13. Limpe a arena e as placas de vidro com etanol a 70% (Etapa 1.4) e substitua os tubos conectores dentro do gabinete à prova de luz. Para agilizar os experimentos, uma nova arena limpa pode ser usada e a arena suja limpa durante a realização de execuções experimentais.
14. Execute outro experimento com um novo lote de moscas, se necessário. Se vários experimentos forem realizados no mesmo dia, tome muito cuidado para garantir que nenhum odorante seja deixado no sistema de um teste anterior. Normalmente, isso não é um problema com baixas concentrações de odores ou com CO₂, mas para estímulos altamente concentrados pode ser necessário um intervalo de até 24 horas entre as execuções experimentais. Além disso, todos os tubos após os tubos de fluxo podem ser substituídos se houver suspeita de contaminação por odor durante os experimentos de controle. Sempre deixe o ar seco entre os experimentos para lavar continuamente o sistema.

2. Análise dos dados

NOTA: O software de aquisição de rastreamento de moscas sugerido (detalhado em Materiais), rastreia moscas em tempo real durante a aquisição e salva o carimbo de data/hora e as coordenadas de todas as moscas detectadas no formato *.dat. Desenvolvemos uma rotina Matlab personalizada para converter os dados em um formato Matlab e analisar os dados. Exemplos de código são fornecidos em Materiais Suplementares, mas os detalhes da implementação dependerão do software usado para aquisição de dados.

1. Carregue os dados brutos. Crie uma máscara espacial que siga os contornos da arena e aplique a máscara aos dados brutos para remover todos os pontos de dados que estão fora da arena, pois representam ruído (Figura 2A, Código Suplementar MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
2. Remova todos os pontos de dados que se movem a uma velocidade abaixo de 0,163 cm/s por mais de 3s, pois esses dados provavelmente são ruídos ou gerados por moscas que não se movem (Figura 2B, Código Suplementar TemporalFiltering.m).
3. Visualize os pontos de dados restantes plotando-os todos de uma vez ou como trajetórias únicas (Figura 1, Código Suplementar SingleTrajectoryViewer.m).
   OBSERVAÇÃO: A localização dos limites de odor nos quatro campos provavelmente depende de vários fatores, como as características de cada odorante e as taxas de fluxo de ar que estão sendo usadas. Por exemplo, odores altamente voláteis provavelmente preencherão o quadrante de odores mais completamente do que odores menos voláteis. Assim, é provável que cada odorante possa exibir limites de odor ligeiramente diferentes. O uso de um detector de fotoionização para medir os limites de odor pode ser problemático, pois usa um vácuo para coletar amostras de ar de um determinado local e, assim, interrompe a concentração de odor naquele local. No entanto, os limites de odor podem ser rapidamente estimados com base em dados comportamentais de moscas. Por exemplo, um limite de odor baseado em rastros de moscas acumulados em resposta a diferentes odores pode ser claramente observado em Figura 1C e 1D.
4. Calcule um índice de atração para determinar se os experimentos de controle não geram resposta de preferência e também para acessar a resposta a um estímulo odorífero (ou optogenético). Para calcular um Índice de Atração (AI), use os últimos 5 minutos de uma gravação de controle ou teste. Para obter uma medida de atração que caia entre +1 (atração absoluta) e -1 (repulsão absoluta), a seguinte fórmula é usada para calcular a IA:
   
   onde N_teste é o número de pontos de dados no quadrante de teste, N_controle é o número médio de pontos de dados nos três quadrantes de controle. Essa medida é intuitiva, pois nenhuma preferência seria indicada por valores próximos de zero. No entanto, não indica corretamente a proporção do número total de moscas localizadas no quadrante odorante. Para obter essa medida, um Índice Percentual (IP) pode ser utilizado:
   
   onde N_teste é o número de pontos de dados no quadrante de teste e N_total é o número total de pontos de dados em todos os quatro quadrantes. Essa fórmula fornece uma medida que fica entre 0 e 1, com 0,25 correspondendo a nenhuma preferência comportamental (Figura 1E e 2C, Código Suplementar AttractionIndex.m).
5. Execute de 5 a 10 repetições de cada condição experimental, usando um novo grupo de moscas para cada repetição. Compare os índices de atração entre condições ou com controles usando o teste não paramétrico de Kolmogorov-Smirnov (Figura 1F, função kstest2 em Matlab).

Resultados

Figura 1: Exemplo de dados gerados usando um ensaio olfativo de quatro campos. (A) Esquema da arena de quatro campos. (B) Respostas neutras são observadas quando todos os quatro quadrantes contêm apenas perfusão de ar seco. (C) Respostas de atração a uma diluição de 6,25% de vinagre de maçã perfundido no quadrante superior esquerdo. (D) Comportamentos de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de fornecimento de ar			(Quantidade necessária)
Tubulação e conectores
Coletores NPT(F) termoplásticos	Cole-Parmer, IL, EUA	R-31522-31	1
Bico redutor hexagonal (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, EUA	Rolamento 5232T314	1
Tubulação (ID: 1/8)	McMaster-Carr, IL, EUA	5108K43	50 pés
Tubulação (ID: 1/16)	McMaster-Carr, IL, EUA	Rolamento 52355K41	100 pés
Conexões para tubos farpados	McMaster-Carr, IL, EUA	5117K71	1 pacote
Conexões de tubo push-to-connect	McMaster-Carr, IL, EUA	5779K102	4
Conexões de tubo farpado (1 / 4MNPT->1 / 8BF)	McMaster-Carr, IL, EUA	Rolamento 5463K439	1 pacote (10)
Conexões de tubo farpado (1 / 8MNPT->1 / 8BF)	McMaster-Carr, IL, EUA	Rolamento 5463K438	2 unidades (10)
Conexões de tubo farpado (1 / 8MNPT->1 / 16BF)	McMaster-Carr, IL, EUA	5463K4	2 unidades (10)
Conexões de tubo farpado (1 / 4MNPT->1 / 4BF)	McMaster-Carr, IL, EUA	5670K84	1
Plugue de cabeça sextavada	McMaster-Carr, IL, EUA	Rolamento 48335K152	1
Regulador de pressão de ar, filtro de ar e medidores de vazão			(Quantidade necessária)
Unidade de secagem de gases laboratoriais	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, EUA	Modelo: L68-NP-303; estoque #26840	1
Estruturas multitubos para tubos de fluxo de 150 mm	Cole-Parmer, IL, EUA	R03215-30	1
Estruturas multitubos para tubos de fluxo de 150 mm	Cole-Parmer, IL, EUA	R03215-76	1
Tubos de fluxo de 150 mm	Cole-Parmer, IL, EUA	R-03217-15	9
Cartucho de válvula	Cole-Parmer, IL, EUA	R-03218-72	9
Regulador de ar de precisão	McMaster-Carr, IL, EUA	6162K13	1
Válvulas solenoidais	Automate Scientific, Berkeley, CA	02-10i	4
Controlador de válvula solenóide	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA	18 de janeiro	1
Medidor de vazão eletrônico	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) e um	Instrumentos nacionais	NI USB-6009	1
fonte de alimentação	Instrumentos Extech	Rolamento 382200	1
Câmaras de odor
Frasco de Polipropileno de Boca Larga 2 oz; 60 ml	Nalgene	Rolamento 562118-0002	Pelo menos 5 são necessários por experimento, mas uma câmara separada é necessária para cada diluição de cada odorante. Disponível na Container Store, parte #635114)
Câmara de odor de vidro, 0,25 onças	Garrafa Sunburst	LB4B	Pelo menos 5 são necessários por experimento
Válvula "In" para câmara de odor	Smart Products, Inc., CA, EUA	214224PB-0011S000-4074	1 dessas peças é usada por câmara de odor, mas elas precisam ser substituídas com frequência
Válvula de "saída" para câmara de odor	Smart Products, Inc., CA, EUA	224214PB-0011S000-4074	1 dessas peças é usada por câmara de odor, mas elas precisam ser substituídas com frequência
Anel O	RT Dygert International, MN, EUA	AS568-029 Buna-N O-R	1 pacote (100)
Arena de voo, câmera e caixas de comportamento			(Quantidade necessária)
Comportamento e material da caixa da câmera	Plásticos interestaduais, CA, EUA	ABS extrudado preto (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 polegadas quadradas
Teflon para inserções de arena de mosca e câmara de odor, 3/8" de espessura, 12" x 12"	McMaster-Carr, IL, EUA	8545K27	1
Placas de vidro, 1/8 "de espessura, 9" x 9 "	McMaster-Carr, IL, EUA	8476K191	algarismo
Controlador termoelétrico de dupla ação	WAtronix Inc, CA, EUA	DA12V-K-0	1
Matriz de LED IR	Iluminação Avançada, Rochester, VT, EUA	AL4554-88024, PS24-TL	2 matrizes de LED e uma fonte de alimentação
Unidade de ar condicionado	Loja Melcor	MAA280T-12	1
Sistema de imagem			(Quantidade necessária)
Cosmicar / Pentax C21211TH (12,5 mm F / 1.4) Lente C-mount	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, EUA	PEC21211 KP	1
Cabo de interconexão CCXC-12P05N	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, EUA	SOCCXC12P05N	1
Adaptador de câmera DC-700	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, EUA	SODC700	1
P+L 40,5 093 Filtro IR	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, EUA	65-072442	1
Polarizador circular TiFFEN 40,5 mm	amazona		1
Câmera de vídeo IR	Fonte de visão industrial, Flórida, EUA	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
Conversor de vídeo USB	A fonte de imagem, NC, EUA	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (software de rastreamento de moscas)	Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
Software de captura de IC	A fonte de imagem, NC, EUA	(http://www.theimagingsource.com/)
variado			(Quantidade necessária)
Ferramenta rotativa Dremel	Dremel, Racine, WI, EUA	Dremel 8000-03	1
Brocas diamantadas para corte de vidro	Disponível em vários fornecedores; MSC Industrial Supply Co, Melville, NY	90606328	1