drosófila Ensaio de labirinto em Y: um método para avaliar as respostas olfativas em moscas

Neste artigo

Resumo

Fonte: Simonnet, M. M., et al. Testando o olfato de Drosophila com um ensaio de labirinto em Y. J. Vis. Exp. (2014).

Este vídeo descreve um método para testar o comportamento exploratório olfativo na mosca da fruta, chamado de labirinto em Y. O clipe de protocolo apresentado demonstra como configurar e conduzir o ensaio.

Protocolo

Este texto de protocolo é um trecho de Simonnet et al., Testando o olfato de Drosophila com um ensaio de labirinto em Y, J. Vis. Exp. (2014).

1. Antes de começar

Use um estoque de referência isogenizado com fenótipos comportamentais estáveis e robustos. Não existe uma regra geral para a escolha dessa linhagem, uma vez que todos os controles potenciais podem conter alelos de fundo heterogêneos.
Use esta tensão de controle para retrocruzar todos os outros estoques necessários para etapas posteriores. Essa etapa de retrocruzamento é normalmente representada por pelo menos 5 cruzamentos sucessivos de uma única fêmea virgem (para permitir um possível cruzamento entre cromossomos homólogos) para 2–3 machos de referência isogênicos. Esta etapa é importante para homogeneizar o fundo genético entre os diferentes estoques de moscas.
Manter estoques de Drosophila em farinha de milho padrão (9%), fermento (10%) e meio de ágar (1,5%) complementado com antibiótico (0,4% de para-hidroxibenzoato de metila) em um ciclo claro/escuro de 12 horas a 25 ° C.
Realize experimentos quimiossensoriais em uma sala com temperatura controlada (25 ° C) sob luz vermelha distante (para eliminar a contribuição de pistas visuais e focar em sinais quimiossensoriais). Renove regularmente o ar da sala para ventilar a área entre cada experimento.

2. Resposta olfativa usando um ensaio de labirinto em Y

Deixe as moscas morrerem de fome por 16 a 18 horas a 25 ° C em tubos de vidro contendo papel toalha úmido antes do teste.
Junte um conector em forma de Y a dois frascos de vidro e a um frasco de plástico menor (frasco de carregamento). Use pontas de pipeta de 1 ml que passam pelas rolhas de espuma para ligar o conector aos três frascos e obter um labirinto em Y hermeticamente fechado. Corte as extremidades estreitas de duas pontas de pipeta (~ 2 mm de diâmetro, para evitar qualquer retorno da mosca depois de tomar sua decisão) para formar dois frascos de "armadilha" e uma extremidade grande de uma ponta de pipeta para formar o tubo de "carregamento" ( Figura 1A).
Imediatamente antes de conectar os frascos "armadilha" (Figura 1B), coloque um papel de filtro de ~ 6 mm de diâmetro em cada frasco. Adicionar 40 μl de solução odorífera num papel de filtro e 40 μl do solvente correspondente no segundo papel de filtro.
Introduza dez moscas de 4 a 9 dias no frasco de "carregamento". Não use anestesia com CO₂ durante esta transferência, pois tem um forte efeito no comportamento. Em vez disso, use um breve resfriamento no gelo. A manipulação adequada de moscas anestesiadas é importante para limitar o estresse sobre os sujeitos o máximo possível.
1. Realize uma série de testes de labirinto em Y a 25 °C sob luz vermelha distante (usando lâmpadas LED para limitar possíveis fontes de aquecimento) para evitar estímulos visuais tanto quanto possível. Tenha o cuidado de alternar as orientações dos labirintos em Y (tubo contendo odor à esquerda ou à direita e tubo de carregamento na frente ou atrás; Figura 1C).
2. Aguarde várias horas para que as moscas entrem no frasco da armadilha que contém o odor ou o solvente. Conte moscas após 24 horas para aumentar a participação em até mais de 80% e fornecer o valor máximo do índice olfativo (Simonnet, comunicação pessoal).
3. Calcular o índice olfactivo resultante utilizando a seguinte fórmula: (número no tubo de odor - número no tubo de solvente)/número total de moscas carregadas.
Lave a configuração do labirinto em Y da seguinte maneira: mergulhe a configuração desmontada em RBS 35 MD durante a noite. Enxágue bem com água da torneira. Por fim, enxágue com água deionizada e deixe secar.

3. Análise Estatística dos Dados

Realize um teste t, uma ANOVA de uma via ou uma ANOVA de duas vias, dependendo dos dados e das variáveis.

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Resultados

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Figura 1: Resposta olfativa masculina avaliada com uma configuração de labirinto em Y. A) Dispositivo dividido. B) Dispositivo montado. C) Configuração em condições de trabalho sob luz vermelha distante. D) Quantificação das respostas olfativas masculinas ao ácido acético (AA) ou ácido fenilacético (PAA), ambos diluídos em água destilada (10% v/v) (N = 1...