Este protocolo é um trecho de Brust-Mascher e Scholey, Técnicas de microinjeção para estudar a mitose no embrião sincicial de Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2009).
Receitas:
Pratos de suco de uva:
- 5,5g de ágar bacto
- 14,5 g de dextrose ou glicose
- 7,15 g de sacarose
- 45 ml de concentrado de suco de uva (100% suco).
- 204,5 ml H20
- 625 μl 10N NaOH
Misture todos os ingredientes e leve ao microondas até ferver.
Adicionar 2,8 ml de mistura ácida (mistura ácida: 20,9 ml de ácido propiónico, 2,1 ml de ácido fosfórico, 27 ml de H20)
Misture e despeje em placas de Petri de 35 mm. Deixe solidificar em temperatura ambiente por um ou dois dias. Se as placas não forem utilizadas em breve, fechar com parapelícula e manter a 4 °C (deixar equilibrar em RT antes de utilizar).
Pasta de fermento:
Dissolva cerca de uma colher de chá de fermento (Sigma YSC2, fermento de Saccharomyces cerevisiae tipo II) em água para formar uma pasta grossa. Coloque uma pequena quantidade disso em cada prato de suco de uva antes de usar.
Tampão de injeção:
- 150 mM de K-Aspartato
- 10 mM de K-fosfato
- 20 mM de imidazol, pH 7,2
Cola de heptano:
Desenrole a fita adesiva dupla e coloque em uma garrafa de 100ml, adicione cerca de 50ml de heptano, feche a garrafa e balance por vários dias. Ao usar, adicione heptano se a cola for muito grossa.
Câmara de desidratação:
Pegue uma placa de Petri de 100 mm, coloque uma parte de uma placa de 35 mm dentro para fazer uma "mesa" e adicione Drierite (sulfato de cálcio anidro) ao redor dela para que a altura da Drierite não seja maior que a "mesa" e a tampa. A lamínula com embriões será colocada nesta "mesa" para desidratação antes da injeção. É uma boa ideia usar pelo menos alguns indicadores de Drierita e alterá-lo quando mudar de cor.
Protocolo:
Este protocolo pode ser usado para injeção de praticamente qualquer reagente solúvel no embrião sincicial de Drosophila: por exemplo, uma proteína fluorescente para observação ou um inibidor de proteína alvo ou ambos.
1. Coleta de embriões
- Coloque um novo prato de suco de uva na gaiola
.
- Retire este prato após uma hora, esta é a primeira coleta do dia e muitas vezes não é muito boa. Pode ser descartado.
- Troque a placa a cada hora para continuar coletando embriões por uma hora cada.
2. Preparação da lamínula
- Coloque uma lamínula de 50 x 22 mm em um lado de uma lâmina de microscópio. Cole os quatro cantos no slide para que ele não se mova.
- Usando um aplicador com ponta de algodão, coloque uma camada de cola de heptano em uma linha na lamínula (a cola não deve ser viscosa e deve secar em alguns segundos, caso contrário, adicione mais heptano).
- Coloque um pedaço de fita adesiva dupla no slide em direção ao lado da lamínula.
3. Preparação do embrião
NOTA: Os embriões devem ser fotografados cerca de 2 horas após o início da coleta, portanto, inicie as etapas a seguir, permitindo tempo suficiente para terminá-los dentro desse prazo.
- Com um pincel umedecido, retire cuidadosamente os embriões do prato de suco de uva e coloque em fita adesiva dupla na lâmina.
- Usando a parte externa da pinça, role os embriões sobre a fita adesiva dupla até que o córion (a membrana externa) se abra.
- Pegue o embrião rolando-o suavemente sobre o córion para que ele grude na pinça e coloque-o sobre a cola de heptano na lamínula com o lado comprido do embrião paralelo ao lado comprido da lamínula. Configure de 10 a 20 embriões em uma fileira.
- Retire a lamínula e coloque-a na câmara de desidratação por 3 a 8 minutos (isso depende da umidade do ambiente e da quantidade a ser injetada).
- Coloque em uma câmara de metal com graxa a vácuo.
- Cubra os embriões com óleo de halocarbono 700 para evitar mais desidratação. Os embriões estão agora prontos para injeção.
4. Injeção de embriões
- Encontre os embriões sob uma objetiva de 16x.
- Afaste os embriões e encontre a agulha sem mover o plano focal.
- Centralize a agulha e mova-a para cima sem movê-la na direção x ou y.
- Se a agulha não estiver aberta, coloque a borda da lamínula no campo de view, mas não onde a agulha estará, e abaixe a agulha para o mesmo plano focal. Mova a lamínula com muito cuidado até que ela atinja a agulha e a abra suavemente. Se a agulha estiver aberta, vá para a etapa 5. (As agulhas podem ser abertas com ácido fluorídrico antes do enchimento).
- Coloque os embriões à vista (mas não onde a agulha estará), abaixe a agulha no óleo e certifique-se de obter boas gotas líquidas da agulha.
- Com cuidado, mas com firmeza, mova o embrião para a agulha e injete uma gota no embrião e afaste o embrião. (Ou siga as instruções do seu aparelho de injeção).
- Depois que todos os embriões foram injetados, eles estão prontos para observação em um microscópio confocal.
