Ensaio de ponto de luz: um método para investigar o comportamento fototático da Drosophila

Resumo

Fonte: Sun, Y., et al. Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis. J. Vis. Exp. (2019).

As larvas de Drosophila são sensíveis à luz e respondem às mudanças na luz circundante. Este vídeo descreve um ensaio que testa sua capacidade de evitar a luz, chamado de ensaio do ponto de luz. O protocolo apresentado demonstra como configurar o ensaio com um LED de luz azul e mostra como registrar o comportamento do animal em resposta ao encontro com a luz.

Protocolo

Este texto de protocolo é um trecho de Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp.(2019).

1. Configuração do sistema de imagem

1. Prenda uma câmera web de alta resolução com um clipe de ferro, cerca de 10 cm acima do ponto de luz na área de trabalho (Figura 1).
2. Ajuste a orientação da lente da câmera em direção à área de trabalho. Conecte a câmera a um computador por meio de uma interface USB.
3. Coloque uma placa de ágar na área de trabalho logo abaixo da câmera.
4. Abra o software "Amcap9.22" no computador com Windows 7 e o ponto de luz será mostrado automaticamente na janela do AMcap. Mova a câmera ligeiramente para a esquerda ou para a direita para garantir que o ponto de luz esteja próximo ao centro da janela. Certifique-se de que a câmera não bloqueie o caminho da luz. O ponto de luz deve ser completo e redondo.
   OBSERVAÇÃO: O software pode ser encontrado em http://amcap.en.softonic.com/.
5. Fixe um filtro passa-banda de 850 nm ± 3 nm com um clipe a 5-7 mm logo abaixo da câmera.
   OBSERVAÇÃO: O diâmetro do filtro é de cerca de 2,5 cm e a lente da câmera tem menos de 1 cm de diâmetro, para que o filtro possa cobrir o campo visual da câmera. Com o filtro abaixo da câmera, o ponto de luz não deve ser visto na janela do AMcap.
6. Colocar três LEDs geradores de luz infravermelha (comprimento de onda central = 850 nm) uniformemente à volta da placa de ágar. Cada LED deve estar a cerca de 5 cm de distância da borda da placa de ágar e a face da lente do LED deve estar em um ângulo de 70° para baixo em direção à placa de ágar. Conecte os LEDs à alimentação através do conversor CA para CC.
   OBSERVAÇÃO: É melhor fixar as posições e ângulos dos LEDs de luz infravermelha para garantir a consistência do brilho do campo em vários ensaios experimentais e facilitar o processamento de vídeo posterior.
7. Coloque um quadro preto entre o computador e o dispositivo. Defina o brilho da tela do computador para evitar que a luz da tela do computador afete o experimento.
   OBSERVAÇÃO: Mantenha o ambiente escuro ao medir o comprimento de onda ou a intensidade da luz.

2. Configurando parâmetros de imagem

1. No menu do software AMcap, escolha Opções | Dispositivo de vídeo | Capture o formato e defina o tamanho do pixel do vídeo capturado para 800 x 600 e a taxa de quadros para 60 fps.
2. Remova o filtro de baixo da câmera, coloque uma régua sob a câmera e ajuste o foco da câmera para tornar a linha de escala clara e paralela à largura do campo de visão do vídeo.
3. Clique em Capturar | Configurar | Captura de vídeo para selecionar o caminho de salvamento, clique em Iniciar gravação, registre a distância real correspondente a 600 pixels e calcule a proporção de cada pixel em relação à distância real.

3. Gravação de vídeo do comportamento de prevenção de luz

1. Manter uma temperatura de 25,5 °C em todas as experiências. Controle a temperatura da sala com um ar condicionado, se necessário. Mantenha a umidade constantemente em 60% com um umidificador.
2. Faça um pequeno vídeo da posição do ponto de luz chamado "lightarea1". Em seguida, mova o filtro de 850 nm ± 3 nm para trás para cobrir a lente da câmera.
   OBSERVAÇÃO: Ao registrar o comportamento larval, a lente da câmera é coberta pelo filtro de 850 nm ± 3 nm para que o ponto de luz não seja mostrado no vídeo. O ponto de luz pode ser reconstruído em vídeos com larvas posteriormente com Matlab. Não altere a posição da câmera e evite alterar a proporção de cada pixel em relação à distância real medida na etapa 2.3.
3. Acenda uma luz (ou seja, uma luz de sala) longe do dispositivo experimental. Abaixe a luz o mais baixo possível, desde que as larvas possam ser vistas claramente com os olhos. Retire as larvas do meio de cultura com uma colher, escolha delicadamente uma larva de terceiro ínstar e lave-a com água destilada. Tenha cuidado para lavar as larvas, uma de cada vez, para evitar a interferência da fome. Um único experimento requer pelo menos 20 larvas.
4. Transfira a larva para o centro da placa de ágar colocada abaixo da câmera durante a etapa 1.3. Remova suavemente o excesso de água da larva com uma escova ou use papel mata-borrão para remover a água da larva para evitar o reflexo da luz sob a lente. Desligue a luz ambiente e deixe a larva se aclimatar por 2 min no ambiente escuro.
5. Ligue a luz LED para gerar luz infravermelha e escove suavemente a larva para o centro da placa. Quando a larva começar a rastejar em linha reta, gire a placa para fazer a larva ir em direção ao ponto de luz. Certifique-se de que ele rasteja direto desde o início, caso contrário, pode não obter acesso ao ponto de luz.
6. Clique em Capturar | Configurar | Captura de vídeo para selecionar o caminho de salvamento e clique em Iniciar gravação para gravar. Deixe a larva rastejar em direção ao ponto de luz, entre no ponto de luz e saia do ponto de luz até que esteja quase fora do campo de visão. Clique em Parar gravação. Se a larva se afastar do ponto de luz antes de se aproximar, clique diretamente em Parar gravação.
7. Afaste o filtro da câmera. Faça um pequeno vídeo da posição do ponto de luz chamado "lightarea2" e compare-o com "lightarea1" para garantir que a posição do ponto de luz não seja alterada. Se uma mudança de posição óbvia for observada, descarte os dados.

Resultados

Figura 1: Configuração experimental. (A) Representação esquemática da configuração para o ensaio de fototaxia rápida de larvas baseado em pontos de luz. As linhas azuis representam os caminhos da luz visível usada como estimulação visual e as linhas vermelhas representam os caminhos da luz infravermelha. As setas indicam a direção da luz. O filtro passa-banda de 850 nm permite a passagem da luz infraverm...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
LED gerador de luz infravermelha de 850 nm ± 3 nm	Thorlabs, EUA	PM100A	Sensores compatíveis: fotodiodo e térmico Faixa de potência óptica: 100 pW a 200 W Faixa de comprimento de onda do sensor disponívela: 185 nm-25 μm Taxa de atualização da tela: 20 Hz Largura de banda: DC-100 kHz Faixa do sensor de fotodiodob: 50 nA-5 mA Faixa do sensor de termopilhab: 1 mV-1 V
Conversor AC para DC	Thorlabs, EUA	S120VC	Tamanho da abertura: Ø9,5 mm Faixa de comprimento de onda: 200-1100 nm Faixa de potência: 50 nW-50 mW Tipo de detector: Fotodiodo Si (UV estendido) < br / > Linearidade: ±0,5% Incerteza de medição: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
Filtro passa-banda	Thorlabs, EUA	DC2100	Faixa de corrente do LED: 0-2 A Resolução de corrente do LED: 1 mA Precisão da corrente do LED: ±20 mA Tensão direta do LED: 24 V Faixa de frequência de modulação: 0-100 kHz Onda senoidal Modulação: Arbitrária
Luz azul LED colimada	ELP, China	USBFHD01M	Resolução: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Console compacto do medidor de potência	Ocean Optics, EUA	USB2000+(RAD)	Dimensões: 89,1 mm x 63,3 mm x 34,4 mm Peso: 190 g Detector: Sony ILX511B (matriz CCD de silício linear de 2048 elementos) Faixa de comprimento de onda: 200-850 nm Tempo de integração: 1 ms – 65 segundos (20 segundos típicos) Faixa dinâmica: 8,5 x 10^7 (sistema); 1300:1 para uma única aquisição Relação sinal-ruído: 250:1 (sinal completo) Ruído escuro: 50 contagens de RMS Grade: 2 (250 – 800 nm) Fenda: SLIT-50 Lente de coleta do detector: L2 Ordenação: OFLV-200-850 Resolução óptica: ~ 2,0 nm FWHM Luz difusa: <0,05% a 600 nm; <0,10% a 435 nm Conector de fibra óptica: SMA 905 a 0,22 fibra de fio único de abertura numérica
Driver de LED de alta potência	Minhongshi, China	MHS-48XY	Tensão de trabalho: DC12V Comprimento de onda central: 850nm
câmera web de alta resolução	Thorlabs, EUA	MWWHL4	Cor: Branco Quente Temperatura de cor correlacionada: 3000 K Corrente de teste para potência típica do LED: 1000 mA Corrente máxima (CW): 1000 mA Largura de banda (FWHM): N/A Potência elétrica: 3000 mW Ângulo de visão (ângulo total): 120 ° Tamanho do emissor: 1 mm x 1 mm Vida útil típica: >50 000 h Temperatura de operação (sem condensação): 0 a 40 °C Temperatura de armazenamento: -40 a 70 °C Grupo de Riscoa: GR1 – Grupo de Baixo Risco
LED Branco Quente	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25,4 (+0 ~ -0,1) mm Largura de banda: 22±3nm Transmitância de pico: 80% < br / > Comprimento de onda central: 850 nm ± 3 nm
espectrómetro	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap é um aplicativo de captura de fotos e vídeos com recursos avançados de visualização e gravação. É um aplicativo de desktop projetado para computadores que executam o Windows 7 SP1 ou posterior. A maioria dos dispositivos compatíveis com vídeo para Windows e DirectShow são suportados, sejam eles webcams baratas ou placas de captura de vídeo avançadas.
Sensor de potência de fotodiodo padrão	Super Dragão, China	YGY-122000	Entrada: AC 100-240V ~ 50 / 60Hz 0.8A < br / > Saída: DC 12V 2A
Sensor de potência térmica	Thorlabs, EUA	M470L3-C1	Cor: Azul Comprimento de onda nominal: 470 nm Largura de banda (FWHM): 25 nm Corrente máxima (CW): 1000 mA Tensão direta: 3,2 V Potência elétrica (máx.): 3200 mW Tamanho do emissor: 1 mm x 1 mm Vida útil típica: 100.000 h Temperatura de operação (sem condensação): 0 a 40 °C Temperatura de armazenamento: -40 a 70 °C Grupo de Riscob: GP2 – Grupo de Risco Moderado
Sensor de potência térmica	Thorlabs, EUA	S401C	Faixa de comprimento de onda: 190 nm-20 μm Faixa de potência óptica: 10 μW-1 W (3 Wb) < br / > Tamanho da abertura de entrada: Ø10 mm Área ativa do detector: 10 mm x 10 mm Densidade máxima de potência óptica: 500 W/cm2 (média) Linearidade: ±0,5%