Dissecção da glândula anelar larval: isolamento de órgãos endócrinos de desenvolvimento de Drosophila

Resumo

Fonte: Imura, E., et al. Protocolos para visualização de órgãos esteroidogênicos e seus órgãos interativos com imunocoloração na mosca-da-fruta Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo descreve a glândula anelar de Drosophila, uma estrutura endócrina complexa importante para a biossíntese e secreção de ecdisteróides e outros hormônios. O protocolo apresentado demonstra sua dissecção, fixação e imunocoloração.

Protocolo

Este protocolo é um trecho de Imura et al., Protocolos para visualização de órgãos esteroidogênicos e seus órgãos interativos com imunocoloração na mosca da fruta Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

NOTA: O esquema geral dos protocolos é mostrado em Figura 1.

1. A Dissecção da Glândula Anelar Larval (RG)

NOTA: Em D. melanogaster, que pertence aos dípteros ciclorráfalos, o PG está dentro de um órgão endócrino composto chamado glândula anelar (RG, Figura 2D). Como é inviável que o PG seja separado cirurgicamente de outros tipos de células (discutido posteriormente), um alvo prático é isolar um RG intacto e não danificado por dissecção.

1. Preparação de larvas nos estágios de desenvolvimento apropriados
   OBSERVAÇÃO: Para sincronizar os estágios de desenvolvimento das larvas de D. melanogaster, é necessário coletar ovos dentro de uma janela de tempo estreita e coletar larvas nos momentos apropriados.
   1. Recolher os ovos durante 2 h numa placa de ágar-ágar sumo de uva a 25 °C.
   2. Colete larvas de^1º ínstar recém-eclodidas sob um microscópio de dissecação com fórceps e transfira-as para um pequeno frasco contendo fermento padrão amassado / alimento para moscas de fubá.
      OBSERVAÇÃO: A idade das larvas é representada por "horas após a postura dos ovos (hAEL)", "horas após a eclosão (hAH)" ou "horas após a ecdise L3 (hAL3E)".
   3. No momento apropriado, colete as larvas estagiadas com um laço de plástico descartável para evitar ferimentos indesejáveis. Para minimizar uma diferença na progressão do desenvolvimento das larvas de^3º ínstar, colete as larvas de 2º^ínstar a 70 hAEL (48 hAH) e deixe-as mudar em intervalos de 2 h. Em seguida, colete as larvas do^3º ínstar dentro de 2 h após a ecdise L3; este procedimento dá 0-2 larvas de hAL3E.
   4. Transfira as larvas estadiadas para um prato cheio de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   5. Enxágue as larvas com PBS para remover os restos de comida do corpo.
2. Dissecção grosseira de larvas sob microscópio de dissecação
   1. Segure o gancho da boca de uma larva com uma pinça. Corte o corpo larval no terço anterior do comprimento do corpo usando uma microtesoura.
   2. Segure a extremidade cortada do corpo larval anterior com um par de pinças. Usando o outro par de pinças, empurre suavemente a ponta da cabeça em direção ao interior do corpo; Este procedimento vira o corpo larval do avesso.
      OBSERVAÇÃO: Esta etapa pode ser ignorada para a dissecção de larvas de^1º ínstar.
   3. Repita as etapas 1.2.1-1.2.2 com larvas adicionais por 5-10 min.
      OBSERVAÇÃO: O número de larvas deve ser igual ou inferior a 20 para economizar tempo para dissecação.
3. Fixação e coloração de tecido com imuno-histoquímica
   1. Coloque o terço anterior dos corpos larvais (etapa 1.2.2) em um microtubo de 1,5 mL preenchido com 500 μL de solução fixa (paraformaldeído a 4% em PBS). Fixe menos de 20 amostras de uma vez, caso contrário, o PBS anexado às amostras fixadas pode causar uma diluição desfavorável do fixador. Para dissecação de filete, remova uma gota de PBS e, em seguida, adicione uma gota de fix solution.
      OBSERVAÇÃO: Para solução fixa, formaldeído a 3,7% ou paraformaldeído a 4% podem ser usados.
   2. Incubar os tecidos dissecados na solução fixa durante 30 min à temperatura ambiente (RT) ou, em alternativa, durante 2 h a 4 °C.
   3. Substitua a solução fixa por 500 μL de PBS e enxágue rapidamente as amostras 3 vezes. Lave as amostras com 500 μL de PBT a 0,3% (PBS + etoxilato de octilfenol a 0,3%) por 15 min em um balancim em RT. Para a dissecção do filé, remova os pinos de insetos e transfira as amostras para um microtubo de 1,5 mL.
      OBSERVAÇÃO: Para aumentar a permeabilidade dos anticorpos nos tecidos, as amostras são tratadas com 500 μL de PBT a 2,0% por 1-2 h em um balancim em RT.
   4. Substitua o PBT por 500 μL de solução de bloqueio (albumina de soro bovino a 2% em PBT). Incubar as amostras durante 1,5 h num balancim à RT.
   5. Substituir a solução de bloqueio por 50 μL da solução primária de anticorpos, ou seja, anticorpos diluídos na solução de bloqueio.
   6. Incubar as amostras durante a noite num balancim a 4 °C.
   7. Substitua a solução de anticorpo primário por 500 μL de PBT a 0,3% e enxágue rapidamente as amostras 5 vezes. Lave as amostras 3 vezes com 500 μL de PBT a 0,3% por 15 min cada em um balancim em RT.
   8. Substitua o PBT a 0,3% por 50 μL da solução de anticorpo secundário (anticorpos conjugados com corante diluídos na solução de bloqueio). Para coloração nuclear, 0,5 μL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, solução estoque de 0,1 mg / mL) é adicionado à solução de 50 μL. Incubar as amostras num balancim durante 2 h a RT ou, em alternativa, a 4 °C durante a noite.
      OBSERVAÇÃO: Mantenha as amostras no escuro.
   9. Substitua a solução de anticorpos por 500 μL de PBT a 0,3% e enxágue 5 vezes. Lave as amostras 3 vezes com 500 μL de PBT a 0,3% por 15 min cada em RT.
4. Dissecção fina do complexo cérebro-RG contendo o PG e montagem
   1. Use uma pipeta descartável para transferir as amostras imunomarcadas para um prato preenchido com 0,3% de PBT.
      OBSERVAÇÃO: Para evitar bolhas inconvenientes durante a dissecção e montagem, o PBT a 0,3% pode ser substituído por PBS.
   2. Sob um microscópio de dissecação, segure a cutícula ou o gancho da boca com um par de pinças. Usando uma agulha de 27 G presa a uma seringa de 1 mL como uma "faca", corte a ponta anterior do esôfago e os discos oculares para remover o complexo cérebro-RG-disco ocular da cutícula do corpo.
   3. Separe o esôfago e o intestino do complexo cérebro-RG-disco ocular com uma pinça. Como o esôfago passa pelo cérebro acima do cordão nervoso ventral (VNC), puxe o intestino para o lado posterior.
      OBSERVAÇÃO: Para remover discos imaginários extras das amostras, corte as conexões entre o cérebro, os discos oculares e os discos das pernas com uma faca de agulha.
   4. Repita as etapas 1.4.1-1.4.4 para outros exemplos.
      OBSERVAÇÃO: Para evitar que os detritos de tecido grudem nas amostras, transfira cada amostra concluída para um prato limpo diferente cheio de 0,3% de PBT ou PBS.
   5. Transfira as amostras para o centro de uma lâmina de vidro limpa com uma micropipeta.
      OBSERVAÇÃO: Para larvas de^2º ou^3º ínstar, a extremidade de uma ponta de micropipeta deve ser truncada com uma lâmina de barbear.
   6. Sob um microscópio de dissecação, alinhe amostras individuais com o lado dorsal para cima usando uma pinça.
      OBSERVAÇÃO: O RG está localizado no lado dorsal do cérebro (Figura 2A). Esse alinhamento facilita a especificação de amostras individuais durante a geração de imagens.
   7. Incline uma lâmina de vidro e limpe o máximo possível de PBT em excesso. Coloque uma gota de reagente de montagem em um lado da lâmina. Coloque a borda de uma lamínula do outro lado da gota e coloque a lamínula nas amostras lentamente com uma pinça.
      OBSERVAÇÃO: Este procedimento evita que as amostras se movam para fora da lamínula.
   8. Conservar as amostras a 4 °C. Manter as amostras à escura.

Resultados

Figura 1: O esquema geral dos protocolos. Dois métodos distintos de dissecação são aplicáveis a larvas e fêmeas adultas, dependendo do objetivo dos experimentos. Os métodos de montagem também são concebidos de acordo com as condições da amostra. As técnicas de fixação, coloração e imagem são basicamente comuns a todas as amostras. Cl...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coleção de ovos
Placa de cultura de tecidos (55 mm)	COMO UM	Rolamento 1-8549-02	para placas de ágar-ágar de suco de uva
copo de coleção	HIKARI KAGAKU
pasta de levedura	Levedura seca oriental, Tóquio
Suco de uva 100%	Welch Alimentos Inc.
larvas de criação
frascos pequenos (12 ml, 40×23,5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
laço descartável	COMO UM	Nº 6-488-01
alimento padrão para moscas			A receita está no site do centro de estoque de Bloomington.
dissecção
microscópio de dissecação	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
microscópio de dissecação	Leica	S8 AP0
Placa de cultura de tecidos (35 x 10 mm, não tratada)	IWAKI	1000-035
Silgard	TORAY		coarting silicone dentro dos pratos
Agulha Terumo (27G, 0,40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	Uma "faca" para cortar o tecido
fórceps, Inox, #5	Dumont, Suíça
alfinete de inseto (0,18 mm de diâmetro)	Marca Shiga		para dissecção de filetes
micro tesoura	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
fixação
Água ultrapura	Merck Millipore
solução salina tamponada com fosfato (PBS)
Formaldeído	Tesque de Nacalai	Rolamento 16222-65
Paraformaldeído	Tesque de Nacalai	02890-45
Tritão-X100	Tesque de Nacalai	35501-15
microtubos (1,5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Incubação
Como um misturador de swist TM-300 (rocker)	Como um	TM-300	roqueiro
Albumina de soro bovino	sigma	9048-46-8
Anticorpo primário
anti-Sro (cobaia), 1:1000
anti-GFP (coelho), 1:1000	Sondas Moleculares	Rolamento A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mAb de camundongo, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (coelho), 1:500	sigma	S5545
anti-Hts 1B1 (mouse)	Banco de Hibridoma de Estudos de Desenvolvimento (DSHB)	1B1
anti-DE-caderina (rato), 1:20	DSHB	DCAD2
Anti-NC82 (mouse), 1:50	DSHB	Próximo a 82
Anticorpo secundário
Anticorpo secundário anti-Rabbit IgG (H + L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 488	Tecnologias da Vida	A-11008
Anticorpo secundário anti-camundongo IgG (H + L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 488	Tecnologias da Vida	A-11001
Anticorpo secundário anti-rato IgG (H + L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 546	Tecnologias da Vida	A-11081
Anticorpo secundário IgG (H+L) anticobaia de cabra, conjugado Alexa Fluor 555	Tecnologias da Vida	A-21435
Alexa Fluor 546 faloidina conjugada com corante	Tecnologias da Vida	A-22283
Reagentes de montagem
Micro vidro deslizante	Matsunami Glass Ind., Ltd.	SS7213
Vidro de cobertura quadrado para microscópio	Matsunami Glass Ind., Ltd.	C218181
Reagente FluorSave (Reagente de montagem)	Calbioquímica	345789
Pipeta de transferência 1 ml (conta-gotas descartável)	Watson	5660-222-1S
Estoques de moscas
w; GMR45C06-GAL4			do Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS-GFP; UAS–mCD8::GFP			presentes de K. Ito, Universidade de Tóquio.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) e Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			do Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			do Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)