Este protocolo é um trecho de Chattopadhyay et al., Métodos locais e globais de avaliação da nocicepção térmica em larvas de Drosophila, J. Vis. Exp. (2012).
1. Ensaio de Sonda de Calor Local
Fornecemos um estímulo térmico nocivo a um segmento individual do corpo larval usando uma sonda térmica personalizada fabricada pela Pro-Dev Engineering (consulte a Tabela de materiais). Embora esta sonda tenha características de design ideais (uma pequena ponta de metal de ~ 0,07 mm2 de área e a capacidade de manter com precisão uma temperatura de ponto de ajuste de 23 °C a 65 °C), em princípio, qualquer ferramenta com uma ponta pequena que possa ser aquecida a uma temperatura definida por um período de até 20 segundos deve ser suficiente. A ponta da sonda é usada para estimular as larvas iniciais do3º ínstar precisamente na linha média dorsal no segmento abdominal A4 (ver Figura 1). Em resposta a esse estímulo térmico, as larvas geralmente exibem um comportamento de retirada aversivo de rolar lateralmente em 360 graus ou mais. Esse comportamento é distinto de sua resposta ao toque leve a uma sonda de metal não nociva à temperatura ambiente, que geralmente envolve uma breve pausa em sua atividade locomotora.
Protocolo para o ensaio de sonda de calor:
- Temperatura pré-definida da sonda térmica para o ponto de ajuste desejado.
- Use um pincel ou fórceps para transferir suavemente uma larva individual para uma plataforma plana (geralmente usamos um pequeno pedaço de vinil cortado de um aglutinante) na qual as larvas serão posteriormente estimuladas. A larva deve ser coberta por uma fina película de água antes do contato com a sonda térmica. A película de água que cobre a larva deve ser o mínimo possível e cobrir completamente a larva, garantindo que a larva não esteja seca ao tocar no vinil.
- Pressione suavemente a ponta da sonda contra a larva no segmento A4 aplicando uma leve pressão com a ponta em um ângulo de cerca de 45° entre a sonda e a superfície da larva (consulte Figura 1). A pressão deve causar um leve recuo na superfície da larva e geralmente será suficiente para evitar a locomoção. Se a larva continuar a se mover, aplique um pouco mais de pressão e ela geralmente parará. Não registre dados de larvas que se movem além do campo de view ou para as quais o contato constante da sonda não pode ser alcançado até a resposta ou o corte de 20 s.
- Continue estimulando a larva até que uma resposta de retirada seja exibida ou até que o limite de 20 segundos seja atingido, o que ocorrer primeiro. As larvas que respondem normalmente mostram primeiro um comportamento preliminar de levantar a cabeça e a cauda. Isso geralmente é seguido pelo comportamento de retirada de rolar pelo menos 360 graus. Apenas uma rolagem completa de 360 graus é pontuada como comportamento nocifensivo (a elevação preliminar da cabeça ou da cauda não é).
- Depois que o comportamento de retirada for iniciado, libere o contato com a sonda e registre a latência ou o tempo de retirada. Se nenhum comportamento de abstinência for observado em 20 segundos, a larva não responde. Os respondentes podem ser divididos em 2 categorias. Se o comportamento de abstinência for mostrado em 5 segundos, a larva responde rapidamente. Se o comportamento de abstinência for mostrado entre 5 e 20 segundos, a larva responde lentamente (ver Figura 1 em Babcock et al., Curr. (2009)).
