Este protocolo é um trecho de Liu et al. Um ensaio de gradiente de temperatura para determinar as preferências térmicas de larvas de Drosophila, J. Vis. Exp. (2018).
1. Configuração do gradiente de temperatura
- Preparar gradiente unidirecional
- Para criar um ambiente úmido durante os ensaios, coloque os dois blocos de alumínio conectados a dois banhos-maria em toalhas de papel molhadas, separados por 10 cm (Figura 1A).
- Ligue os dois banhos-maria ~2 h antes de iniciar o ensaio para dar tempo suficiente para que a temperatura dos blocos de alumínio se equilibre.
OBSERVAÇÃO: Recomenda-se realizar um experimento simulado para determinar a temperatura de cada banho-maria necessária para atingir o gradiente de temperatura linear desejado. Alguns pares de temperatura típicos para definir os banhos-maria estão listados na Tabela 1. No entanto, observe que as temperaturas da superfície são afetadas pela temperatura ambiente. O comprimento da tubulação também afeta as temperaturas, pois há resfriamento nos tubos. O comprimento da tubulação em nossa configuração é de 1,5 m.
- Microondas 100 mL de agarose a 1% na configuração de alta potência em um frasco redondo de boca larga de 500 mL e despeje 25 mL / placa de ensaio em uma bancada nivelada. Prepare duas placas de ensaio, que podem ser colocadas nos blocos de alumínio ao mesmo tempo (Figura 1A).
- Depois que a agarose solidificar (10-20 min), esfregue suavemente cada superfície de agarose com uma esponja de cozinha padrão ou uma esponja de melamina para tornar a superfície da agarose ligeiramente grossa, de modo que, ao borrifar água no gel de agarose, uma membrana de água fina e lisa será criada e nenhuma gota de água se formará.
- Mergulhe totalmente as placas em um recipiente com água destilada até que o ensaio esteja pronto para ser realizado para evitar que as placas fiquem secas.
- Preparar um gradiente bidirecional (opcional)
- Para criar um ambiente úmido durante os ensaios, coloque três blocos de alumínio separados por 8 cm (Figura 1B) em toalhas de papel molhadas.
- Ligue os dois banhos-maria ~2 h antes de iniciar o ensaio para dar tempo suficiente para que a temperatura dos blocos de alumínio se equilibre.
OBSERVAÇÃO: Recomenda-se realizar um experimento simulado para determinar a temperatura de cada banho-maria para o gradiente bidirecional. Alguns pares de temperatura típicos para definir os banhos-maria estão listados na Tabela 2. No entanto, observe que as temperaturas da superfície são afetadas pela temperatura ambiente. O comprimento da tubulação também afeta as temperaturas, pois há resfriamento nos tubos. O comprimento da tubulação em nossa configuração é de 1,5 m.
- Para evitar que a agarose se espalhe para fora da placa, enrole as bordas da placa de alumínio com fita adesiva para formar uma parede de 10 mm de altura (Figura 1B).
- Usando a configuração de alta potência, coloque no micro-ondas 200 mL de agarose a 1% em um frasco redondo de boca larga de 500 mL e despeje 120 mL em uma placa de ensaio.
- Depois que a agarose solidificar (~ 30 min), esfregue suavemente cada superfície de agarose com uma esponja de cozinha padrão ou uma esponja de melamina para tornar a superfície de agarose ligeiramente grossa, de modo que, ao borrifar água no gel de agarose, uma membrana de água fina e lisa seja criada e nenhuma gota de água se forme.
- Mergulhe totalmente as placas de ensaio em um recipiente com água destilada até que o ensaio esteja pronto para ser realizado para evitar que sequem.
- Configurar gradiente unidirecional
- Prepare reagentes e itens em uma bancada ao lado do aparelho de ensaio de gradiente (consulte a Tabela de Materiais).
- Para promover uma transferência de temperatura eficiente, preencha todas as lacunas entre os blocos de alumínio e as placas de ensaio borrifando água na interface entre os blocos e a placa.
- Usando luvas, remova as placas de ensaio do recipiente de água. Se a água invadir entre o gel de agarose e a placa e causar a formação de saliências na superfície, remova a água com uma micropipeta P1000.
- Coloque as placas de ensaio nos blocos de alumínio de modo que as demarcações que estão a 2 cm de cada borda correspondam exatamente às bordas dos blocos de alumínio (Figura 1A,C).
- Borrife água na superfície da placa (uma fina membrana de água cobrindo a superfície da agarose é suficiente) para evitar que o gel de agarose seque. Certifique-se de que a membrana de água seja contínua e livre de gotículas de água, pois as larvas podem ficar presas nas gotículas de água.
- Cubra o sistema de gradiente com uma caixa de papelão para reduzir a evaporação da água e ajudar a estabilizar a temperatura da superfície do gel. Aguarde 5-10 min para permitir que a temperatura se equilibre.
- Verifique a temperatura da superfície em 12 pontos da placa (Figura 1C). Faça duas medições dentro de cada zona para estabelecer se há ou não variabilidade dentro de uma zona. Certifique-se de que a temperatura em ambos os pontos esteja dentro de ± 0,2 °C da temperatura desejada.
OBSERVAÇÃO: A variabilidade dentro de uma zona geralmente ocorre porque as distâncias exatas dos dois pontos até a borda dos blocos de alumínio não são idênticas. Ajuste a posição da placa nos blocos de alumínio para certificar-se de que as demarcações que estão a 2 cm de cada borda correspondam exatamente às bordas dos blocos de alumínio.
- Se o gradiente de temperatura medido se desviar do gradiente desejado, aumente ou diminua a(s) configuração(ões) de temperatura do banho-maria e verifique novamente a temperatura da superfície após a temperatura do(s) banho(s) de água(s) estabilizar(em).
- Cubra o sistema de gradiente com uma caixa de papelão até iniciar o ensaio.
- Configurar gradiente bidirecional (opcional)
- Prepare reagentes e itens em uma bancada ao lado do aparelho de ensaio de gradiente (consulte a Tabela de Materiais).
- Pulverize água nas superfícies dos três blocos de alumínio para promover a transferência eficiente de temperatura dos blocos de alumínio para as placas de ensaio, preenchendo quaisquer lacunas entre as superfícies.
- Remova as placas de ensaio cuidadosamente do recipiente de água e coloque sobre os blocos de alumínio. Se a água invadir entre o gel de agarose e a placa, o que pode causar a formação de saliências na superfície, remova a água com uma micropipeta P1000.
- Coloque a placa de ensaio nos blocos de alumínio de modo que as linhas médias da primeira e da última zonas de cada borda correspondam exatamente às bordas dos dois blocos de alumínio laterais (Figura 1B,D).
- Borrife água na superfície da placa (uma fina membrana de água cobrindo a superfície da agarose é suficiente) para evitar que o gel de agarose seque. Certifique-se de que a membrana de água seja contínua e livre de gotículas de água, pois as larvas podem ficar presas nas gotículas de água.
- Cubra o sistema de gradiente com uma caixa de papelão para reduzir a evaporação da água e ajudar a estabilizar a temperatura da superfície do gel. Aguarde 5-10 min para permitir que a temperatura se equilibre.
- Verifique a temperatura da superfície em dois pontos ao longo da linha média de cada uma das 10 zonas (Figura 1D). Faça duas medições dentro de cada zona para estabelecer se há ou não variabilidade dentro de uma zona. Certifique-se de que a temperatura em ambos os pontos esteja dentro de ± 0,2 °C da temperatura desejada.
OBSERVAÇÃO: A variabilidade dentro de uma zona geralmente ocorre porque as distâncias exatas dos dois pontos até a borda dos blocos de alumínio não são idênticas. Ajuste a posição da placa nos blocos de alumínio para certificar-se de que as linhas médias da primeira e da última zonas mais próximas de cada borda correspondam exatamente às bordas dos dois blocos de alumínio laterais.
- Se o gradiente de temperatura medido se desviar do gradiente desejado, ajuste a(s) configuração(ões) de temperatura do banho-maria e verifique novamente a temperatura da superfície após a temperatura do(s) banho(s) de água.
- Cubra os blocos com uma caixa de papelão até o início do ensaio.
2. Ensaio e Cálculo
- Remova a caixa de papelão e verifique a temperatura da superfície do gel imediatamente antes de transferir as larvas para a placa. Minimize o tempo que a caixa de papelão fica aberta para evitar interromper o equilíbrio da temperatura. Se a superfície estiver seca, borrife uma pequena quantidade de água na superfície.
- Distribua 150 ± 50 larvas perto do centro de cada placa (entre as zonas 3 e 4 das 6 zonas) para o gradiente unidirecional (zona de liberação; Figura 1C).
OBSERVAÇÃO: Para o gradiente bidirecional, distribua 200-400 larvas ao longo da zona média de cada metade (Figura 1D).
- Coloque uma tampa de microplaca sobre cada placa de ensaio para evitar que as larvas rastejem para fora. Cubra a configuração com uma caixa de papelão para evitar a exposição à luz, o que pode afetar a escolha larval no gel de agarose.
OBSERVAÇÃO: Para o gradiente bidirecional, não deve ser necessário cobrir a placa com uma tampa, porque a placa é maior e a temperatura preferida das larvas está na zona intermediária. Consequentemente, poucas larvas se acumulam nas bordas e têm a oportunidade de rastejar para fora.
- Deixar o ensaio prosseguir durante 10-30 min para o gradiente unidirecional e durante 15-35 min para o gradiente bidirecional, dependendo da idade das larvas (Quadro 3).
- Remova a caixa de papelão e a tampa da microplaca. Fotografe as placas de cima usando uma câmera digital. Tire duas fotografias de cada placa de ensaio para que o investigador possa escolher aquela com melhor contraste e brilho para análise.
- Remova todas as larvas das placas de ensaio e de qualquer lugar fora das placas por aspiração.
- Limpe bem as placas de ensaio, os tubos e o filtro de células com água destilada. Reutilize as placas de ensaio preparadas naquele dia, a menos que a superfície da agarose esteja danificada.
- Calcule a distribuição percentual das larvas em cada zona.
- Abra a imagem fotográfica dos resultados do ensaio usando qualquer software que permita adicionar marcações à imagem. Para indicar as zonas de ensaio, desenhe linhas verticais a cada 2 cm com base nas demarcações na placa de ensaio.
- Conte o número de larvas em cada zona e registre os números. Não conte as larvas em regiões a 0,5 cm de qualquer uma das paredes. O gel é mais espesso perto das paredes e as temperaturas da superfície não são lineares nessas regiões.
- Para o gradiente unidirecional, calcule a distribuição percentual em cada zona da seguinte forma:
(número de larvas em uma determinada zona de 2 cm)/ (número total de larvas em 6 zonas) x 100.
- Para o gradiente bidirecional, calcule a distribuição percentual em cada zona da seguinte forma:
(número de larvas em uma determinada zona de 2 cm) / (número total de larvas em 5 zonas de cada lado do gradiente) x 100.
