$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo é um trecho de de Vries e Clandinin, Estimulação Optogenética do Comportamento de Fuga em Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2013).
1. Gerar moscas de channelrhodopsin
- Cruze as moscas UAS-ChR2 com o driver Gal4 de sua escolha, usamos G105-Gal4, que é expresso em neurônios Foma-1 no lobo óptico.
- Para eliminar a possibilidade de uma resposta visual à estimulação da luz azul, ambas as linhas de mosca estão em um fundo w + norpA.
- Resultado final: w+norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Depois que as moscas adultas se aproximarem, coloque as fêmeas selecionadas em alimentos frescos, suplementados com 10 μM de all-trans-retinal (um cofator necessário para ChR2) e protegidos da luz, por 3 dias antes de realizar o ensaio comportamental.
2. Faça 10 μM de Alimentos Aprimorados com Totalmente Trans-retinal
- Dissolva 100 mg de totalmente trans-retinal em 17,6 ml de etanol a 95% para fazer 20 mM de retina. Mantenha todo o trans-retinal protegido da luz o tempo todo.
- Derreta a comida padrão de fubá no micro-ondas e deixe esfriar até ficar quente ao toque.
- Misture 50 μl de 20 mM de all-trans-retinal em frascos para injetáveis de 10 ml de alimento para moscas.
- Deixe os frascos esfriarem e mantenha-os protegidos da luz.
3. Equipamento
- Pontas de pipeta: As pontas de pipeta padrão de 1.000 μl são cortadas perto da ponta, criando um diâmetro de poro de ~2,25 mm.
- Plataforma (consulte Figura 1).
- Uma base Delrin, 17 cm X 25 cm, foi construída com orifícios roscados em cada canto para encaixar conectores de mangueira de refrigerante NPT de 1/4".
- Um suporte vertical, feito de Delrin, é fixado no centro da base. As dimensões totais são 25 mm X 40 mm X 65 mm (largura X profundidade X altura). Uma ranhura de 10 mm de largura percorre o comprimento do suporte, com um parafuso de aperto manual na parte inferior. Uma plataforma é fixada na parte superior do suporte, 25 mm X 40 mm X 10 mm, com um orifício de 3,5 mm de diâmetro alinhado com a ranhura no suporte.
- Matrizes de LED (consulte Figura 1).
- Quatro braços de mangueira de refrigerante, ~ 18 cm de comprimento, são fixados na base da plataforma usando o conector da mangueira de refrigerante. A mangueira de refrigeração é usada apenas como suporte estrutural e não é usada para fins de resfriamento.
- Ranhuras devidamente espaçadas são cortadas na peça final da mangueira de refrigerante de cada braço para fixar um dissipador de calor na extremidade de cada braço.
- Um LED azul Rebel Tri-Stars é montado em cada dissipador de calor usando fita adesiva térmica pré-cortada. Uma lente Carclo 18° Tri-lens é afixada em cada Tri-Star.
- Os LED Tri-Stars são conectados aos drivers BuckPuck DC e a uma fonte de alimentação conforme especificado. Organizamos nossa configuração com cada BuckPuck alimentando dois Tri-Stars em série.
- A iluminação de todos os quatro LED Tri-Stars a 700 mA produziu uma irradiância de 713 W/m2 em nossa plataforma.
- Câmera: A câmera é montada em um pequeno tripé e focada na parte superior da plataforma.
4. Ensaio Comportamental
- Anestesie brevemente as moscas no gelo.
- Coloque moscas individuais nas pontas da pipeta, usando fita adesiva para fechar as duas extremidades da ponta.
- Depois que as moscas acordarem e estiverem explorando ativamente a ponta da pipeta, remova a fita e coloque uma pipeta na ranhura do suporte vertical. O parafuso de aperto manual é usado para prender a ponta da pipeta no lugar e fechar a parte inferior da ponta.
- À medida que a mosca explora a ponta da pipeta (normalmente 30 a 60 segundos), inicie a gravação da câmera pouco antes de a mosca emergir da ponta para a plataforma.
- Depois que a mosca emergir na plataforma, aguarde 1-2 segundos e acenda os LEDs azuis. Use um cronômetro para medir manualmente o tempo até que a mosca inicie o voo.
