Este protocolo é um trecho de Vogler e Ocorr, Visualizando o coração batendo em Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).
1. Antes de começar
- Prepare na hora a solução de hemolinfa artificial (AH) contendo 108mM Na+, 5mM K+, 2mM Ca2+, 8mM MgCl2, 1mM NaH2PO4, 4mM NaHCO3, 10mM sacarose, 5mM trealose, 5mM HEPES (pH 7,1, todos reagentes da Sigma Chemicals). A sacarose e a trealose devem ser adicionadas ao AH a partir de soluções de reserva refrigeradas imediatamente antes do uso, a fim de evitar a contaminação bacteriana.
- Leve AH à temperatura ambiente e oxigene a solução borbulhando ar por pelo menos 15 min.
- Puxe vários capilares finos (por exemplo, capilares de vidro, 100ul, VWR) necessários para a remoção da gordura.
2. Coração de Drosophila semi-intacto da mosca adulta
- As moscas adultas da Drosophila são anestesiadas com Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) por 2-5 minutos. Deve-se tomar cuidado para não deixar as moscas no Fly Nap para exposições mais longas. A exposição de curto prazo ao frio também pode ser usada para anestesiar moscas, mas o CO2 não é recomendado, pois tem efeitos mais duradouros na frequência cardíaca e na ritmica.
- As moscas anestesiadas são colocadas, com o lado dorsal voltado para baixo, em uma placa de Petri revestida com uma fina camada de vaselina. A cutícula hidrofóbica nas asas e no corpo "gruda" reversivelmente na geléia, mas a mosca pode ser reposicionada, se necessário. Isso se torna especialmente importante durante as manipulações subsequentes.
- Um corte inicial é feito usando uma tesoura de mola curva (Roboz # 5611). As lâminas da tesoura são colocadas sob as pernas e inclinadas para baixo em direção à superfície dorsal do tórax, perto do pescoço. A cabeça, o cordão nervoso ventral e as pernas são removidos com um único corte. A preparação é então submersa em uma solução oxigenada de hemolinfa artificial (AH).
- Com a ajuda de uma tesoura de mola, a ponta posterior do abdome (composta pelos segmentos abdominais 7 e 8) é removida com um único corte. Isso fornece acesso para fazer cortes laterais ao longo de ambas as bordas do abdômen e serve para cortar a conexão entre o intestino posterior e a cutícula abdominal. O retalho liberado da cutícula abdominal ventral é então removido.
- Nas etapas 3 e 4, as conexões anterior e posterior do intestino são cortadas, de modo que os órgãos abdominais agora são mantidos no lugar apenas por traqueóis. O intestino e outros órgãos abdominais geralmente podem ser removidos como uma única massa usando pinças de joalheiro (Roboz, # 55) e puxões suaves. A remoção dos órgãos internos revela o tubo cardíaco batendo ainda preso à cutícula dorsal cercado por corpos gordurosos.
- Os corpos gordurosos são bastante opacos no microscópio óptico, conseqüentemente, muitas vezes é necessário remover parte dessa gordura para ver o tubo cardíaco com clareza. Isso é realizado por uma técnica de lipoaspiração usando capilares de vidro finamente trefilados. Os capilares são feitos usando um extrator de pipeta padrão (por exemplo, extrator de pipeta Sutter P-97) e são então inseridos em tubos de plástico (Tygon, 1/16") conectados a uma fonte de vácuo. Este sistema é usado para aspirar o excesso de gordura ao redor do tubo cardíaco. A força de sucção é proporcional ao diâmetro da ponteira, portanto, pipetas com ponteiras maiores que 40 mícrons de diâmetro não devem ser usadas. Deve-se tomar extremo cuidado para evitar tocar no próprio coração e, como a porção posterior do coração é muito frágil, essa região deve ser evitada completamente.
- O tubo cardíaco adulto de Drosophila agora está exposto e deve estar batendo. Se necessário, a cutícula e o coração anexado podem ser reposicionados levantando suavemente a cutícula da vaselina e compactando-a cuidadosamente de volta, evitando novamente qualquer contato com o tecido cardíaco. Neste ponto, a solução que banha a preparação deve ser substituída por AHL fresco. Esta preparação deve ser deixada em equilíbrio por 20-30 minutos com oxigenação antes de qualquer manipulação. Se a preparação for mantida por mais de 60 minutos, ela deve ser perfundida com AHL fresco.
