$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo é um trecho de Gou et al., Ensaio de alto rendimento para examinar as preferências de postura de ovos de Drosophila melanogaster individual, J. Vis. Exp. (2016).
1. Construção da Câmara, Montagem, Configuração do Ensaio
- Peça a uma oficina mecânica que construa câmaras de postura de ovos de acrílico (Figura 1A-D). O desenho de engenharia de diferentes peças foi mostrado na Figura Suplementar 1-3. Imagens de alta resolução também podem ser encontradas aqui (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Insira folhas de plástico na peça de carregamento (superior) da câmara conforme mostrado em Figura 1C. Isso serve como superfície inferior enquanto carrega moscas em arenas individuais de postura de ovos.
- Anestesie as fêmeas em uma almofada de CO2 e carregue-as individualmente em cada arena de postura. Aguarde ~ 30 min para que as moscas se recuperem do CO2 e se aclimatem ao novo ambiente.
- Prepare os substratos de agarose.
- Por conveniência, mantenha uma garrafa pré-fabricada de agarose a 1% derretida em banho-maria a 55 °C.
- Adicione a quantidade desejada de solução de estoque de sacarose (2 M) em um tubo cônico de 50 ml e misture com a quantidade apropriada de agarose. Por exemplo, para preparar o substrato de sacarose 150 mM, coloque 750 μl de solução de sacarose 2 M no tubo e, em seguida, encha o tubo com agarose até a marca de 10 ml.
- Prepare o substrato simples da mesma maneira, mas adicione água destilada em vez de solução de sacarose.
OBSERVAÇÃO: A concentração final de agarose neste protocolo é ligeiramente inferior a 1%. Em nossa experiência, a concentração exata de agarose não importa, desde que seja controlada entre ~ 0,9 - 1,1% e que os dois substratos tenham a mesma concentração de agarose.
- Pegue a peça de substrato (inferior) da câmara e pipete 1.000 μl de substrato de agarose em cada calha, como visto em Figura 1D.
- Deixe a agarose solidificar por ~ 30 min.
- Assim que os substratos de agarose e as moscas estiverem prontos, monte todas as três peças da câmara de postura e, em seguida, retire as folhas de plástico.
- Coloque as câmaras em incubadoras de moscas.
OBSERVAÇÃO: A duração dos experimentos de postura pode variar dependendo das necessidades experimentais. Normalmente executamos o experimento O/N (14 - 16 horas). Além disso, não foi observado impacto significativo do tempo circadiano nas preferências de postura de ovos.
- Anestesie as fêmeas injetando CO2 na câmara. Desmonte a câmara, descarte as moscas anestesiadas no necrotério de moscas (ou seja, uma lata de café vazia cheia de um pouco de óleo de milho). Tire fotos dos resultados para manutenção de registros (consulte Figura 2).
- Conte o número de ovos manualmente e calcule os índices de preferência para análise. Calcule o índice de preferência como (Na - Nb)/(Na + Nb) onde N a e Nb representamo número de ovos no local a vs. local b, respectivamente.
