C. elegans Dissecção de blastômeros: um método para remover a casca do ovo e dissociar células embrionárias

Resumo

Fonte: Hsu, C. R., et al. Reconstituição in vitro de padrões de contato celular espacial com blastômeros embrionários isolados de Caenorhabditis elegans e grânulos de poliestireno adesivos.J. Vis. Exp.(2019).

Este vídeo apresenta um método de isolamento de blastômeros de C. elegans de embriões iniciais. As células resultantes são adequadas para cultura de células ou experimentos ex vivo.

Protocolo

Este protocolo é um trecho de Hsu et al, Reconstituição in vitro de padrões de contato celular espacial com blastômeros embrionários isolados de Caenorhabditis elegans e grânulos de poliestireno adesivos, J. Vis. Exp.(2019).

1. Isolamento de blastômero embrionário
2. Use luvas e jaleco para evitar cortes e contato com a solução de branqueamento.
   1. Segure cada extremidade de um microcapilar (capacidade; 10 μL) com a mão direita e esquerda.
   2. Puxe o microcapilar em direção a ambas as extremidades para aplicar tensão e traga o centro do capilar sobre um queimador para fazer dois capilares puxados manualmente (Figura 1A).
   3. Apare as pontas dos capilares puxados à mão com uma pinça sob o microscópio de dissecação e prenda o capilar puxado em um aparelho de pipetagem bucal. Prepare dois tipos de pipetas. Os tamanhos de abertura da ponta para as pipetas devem ser aproximadamente 2x e 1x o comprimento do eixo curto dos embriões de C. elegans (30 μm) para a transferência de embriões e remoção da casca do ovo, respectivamente Figura 1B-D).
   4. Pipetar 45 μL de solução de sal de ovo para um poço de uma lâmina multipoços (Figura 2A; parte inferior).
   5. Coloque 5-10 adultos C. elegans em um poço contendo solução de sal de ovo.
   6. Para obter embriões iniciais de C. elegans, corte os adultos em pedaços posicionando duas agulhas à direita e à esquerda do corpo de C. elegans e deslizando as agulhas uma sobre a outra (Figura 2A; esquemas superiores).
   7. Pipetar 45 μL de solução de hipoclorito para um poço próximo ao poço contendo solução de sal de ovo (Figura 2B).
   8. Pipete 45 μL do meio de crescimento de Shelton nos três poços subsequentes próximos ao poço contendo solução de hipoclorito (Figura 2B).
   9. Transfira embriões em estágio de 1 célula e estágio inicial de 2 células para a solução de hipoclorito por pipetagem oral com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões (Figura 2B).
   10. Aguarde 40–55 s.
   11. Lave os embriões transferindo-os da solução de hipoclorito para o meio de crescimento de Shelton pipetando com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões (Figura 2B).
   12. Lave os embriões novamente transferindo-os para um novo poço do meio de crescimento de Shelton pipetando com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões (Figura 2B).
   13. Transfira os embriões lavados para um novo poço do meio de crescimento de Shelton pipetando com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões. Usando o capilar desenhado à mão para remoção da casca do ovo, repita cuidadosamente a pipetagem (Figura 2C; esquemas do meio). Se a casca do ovo for removida com sucesso, as células embrionárias se tornarão mais esféricas (Figura 2C; à direita).
   14. Separe os blastômeros embrionários do estágio de 2 células pipetando suave e continuamente com o capilar desenhado à mão para remoção da casca do ovo (Figura 2D).

Figura 1: Isolamento de blastômeros.(A) Tração manual do capilar de vidro. (B) Capilar de vidro desenhado à mão para transferência de embriões. (C) Capilar de vidro desenhado à mão para remoção da casca do ovo. (D) Esquemas mostrando o tamanho apropriado da abertura capilar para a remoção da casca do ovo. As setas indicam embriões. As barras de escala mostram 100 μm.

Figura 2: Fluxo de trabalho de isolamento de blastômeros.(A) Dissecção de C. elegans adultos em tampão de sal de ovo para obtenção de embriões. As fotografias mostram embriões em estágio de 2 e 4 células antes da remoção da casca do ovo. (B) Tratamento e lavagem de hipoclorito. (C) Os esquemas descrevem o momento apropriado para a remoção da casca do ovo. A fotografia mostra um embrião em estágio de 4 células após a remoção da casca do ovo. (D) Separação de blastômeros. A fotografia mostra um embrião separado em estágio de 2 células. Os tamanhos das setas em C e D indicam as forças relativas necessárias durante a pipetagem. As barras de escala mostram 50 μm.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Conjunto de Tubo Aspirador	Drummond	21-180-13	Para o isolamento do blastômero.
Cepa de Caenorhabditis elegans: N2, tipo selvagem	Centro de Genética Caenorhabditis	N2	Cepa usada neste estudo
Cepa de Caenorhabditis elegans: KSG5, genótipo: zuIs45; itIs37	em casa	KSG5	Cepa usada neste estudo
Mircopipets calibrados, 10 μL	Drummond	21-180-13	Para o isolamento do blastômero
CD Concentrado lipídico	Tecnologias da Vida	11905031	Para o isolamento do blastômero. Trabalhe na coifa de cultura de tecidos.
Clorox	Clorox	N. A.	Para o isolamento do blastômero. Abra um novo frasco quando o tratamento com hipoclorito não funcionar bem.
Porta-lamínula	Em casa	N.A.	Para o isolamento do blastômero.
Microscópio de dissecação: Zeiss Stemi 508 com suporte M. A fonte de luz é LED embutido. A ampliação da ocular é de 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	Para o isolamento do blastômero.
Soro Bovino Fetal, Qualificado One Shot, origem do Canadá	Gibco	A3160701	Para o isolamento do blastômero. Trabalhe na coifa de cultura de tecidos.
Agulhas hipodérmicas de uso geral e deslizamento de precisão, calibre 25	Bd	14-826AA	Para o isolamento do blastômero
inulina	Alfa Aesar	AAA1842509	Para o isolamento do blastômero
MEM Solução de Vitamina (100x)	Gibco	11120052	Para o isolamento do blastômero.
Multitest Slide 10 Poços	MP Biomédicos	ICN6041805	Para o isolamento do blastômero
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140148	Para o isolamento do blastômero.
Polivinilpirrolidona	BioReagentes Fisher	BP431-100	Para o isolamento do blastômero
Cloreto de potássio	Bioshop	POC888	Para o isolamento do blastômero
Meio estéril de Drosophila de Schneider	Gibco	21720024	Para o isolamento do blastômero. Trabalhe na coifa de cultura de tecidos.
Cloreto de sódio	Bioshop	SOD001	Para o isolamento do blastômero
Solução de hidróxido de sódio, 10 N	Fisher Química	SS255-1	Para o isolamento do blastômero
Filtros de seringa, PTFE, não estéreis	Basix	13100115	Para o isolamento do blastômero.
Tubulação de laboratório Tygon S3, formulação E-3603, diâmetro interno 3,175 mm	Plásticos de desempenho da Saint Gobain	89403-862	Para o isolamento do blastômero.
Tubulação de laboratório Tygon S3, formulação E-3603, diâmetro interno 6,35 mm	Plásticos de desempenho da Saint Gobain	89403-854	Para o isolamento do blastômero.