C. elegans Ensaio de quimiotaxia: um método para testar a quimiossensação em vermes

Resumo

Fonte: Campbell, J. C., et al. Um ensaio de aversão ao cobre baseado no estado nutricional de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo apresenta a quimiotaxia no nematóide C. elegans e mostra um protocolo de amostra testando a aversão quimiotática ao sulfato de cobre.

Protocolo

O protocolo a seguir é um trecho de Campbell et al, Um ensaio de aversão ao cobre baseado no estado nutricional de Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparação de Organismos Experimentais
   1. Escolha 10 nematóides em estágios L4 por cepa 24 h antes do início do ensaio para garantir que os organismos sejam adultos jovens quando testados. Para cada mutante ou nemátodo de controlo testado, escolher 10 L4s (10 para o controlo e 10 para o ensaio).
      1. Manter os organismos L4 usando métodos padrão por 24 h em placas de ágar padrão semeadas com OP50 Escherichia coli. Se os organismos forem perdidos durante as etapas de lavagem subsequentes, compense aumentando o tamanho da amostra inicial (ou seja, escolha 20 vermes em vez de 10).
         OBSERVAÇÃO: O comportamento é um fenótipo inatamente variável. Executar o método em triplicado para cada estirpe em três dias separados. Inclua cepas de controle adicionais e condições para novas cepas, conforme destacado na seção de discussão.
   2. Imediatamente antes do ensaio, transfira os organismos experimentais para uma placa de ágar sem bactérias e permita que os nematóides se movam livremente por 1 minuto para remover o excesso de bactérias.
      1. Se os organismos experimentais tiverem sofrido condições de contaminação durante as 24 horas anteriores ao ensaio, eliminá-los.
   3. Pipete 1 mL de M9 na placa livre de bactérias para lavar os vermes em um tubo de microcentrífuga.
   4. Centrifugue a 3.000 x g por 1 min. Os vermes devem formar um pellet no fundo do tubo. Aspirar a solução M9 sem interromper o pellet de minhoca. Adicione 1 mL de M9 ao pellet de minhoca, inverta o tubo para misturar as minhocas com a solução.
   5. Repita as etapas 1.4 mais três vezes.
      1. Se o excesso de bactérias foi inicialmente transferido com os vermes, repita por um total de 5 vezes. Nenhuma bactéria deve ser transferida para os pratos de cobre da corrida de alimentos. Se o alimento for transferido para a placa de ensaio, isso interferirá na coleta de dados precisos.
   6. Após a lavagem final, aspirar sobrenadante até 100 μL de M9 e o pellet de minhoca permanece.
      Cuidado: Comportamentos relacionados à fome tornam-se evidentes após 30 min. Consequentemente, os vermes devem ser imediatamente transferidos da solução assim que as etapas de lavagem forem concluídas.
2. Preparação de placas de ensaio
   1. Preparar placas de ágar-ágar NGM padrão dois dias antes do ensaio.
      1. Se as placas forem mantidas em um ambiente úmido, faça placas de ágar 3 dias antes do ensaio. Como alternativa, remova a tampa da placa por 3 a 6 h para garantir a secura adequada (se estiver em um ambiente estéril).
   2. Com um marcador permanente espesso, faça uma linha na parte inferior da placa ao longo da borda externa e outra para formar uma barreira no meio da linha (Figura 1). A barreira da linha média deve estar equidistante de cada borda da placa. Use uma régua para garantir medições precisas. Essas linhas servirão como um guia na transferência de bactérias e da solução de cobre. Desde que a E. coli seja transferida antes da solução de cobre, essas linhas servirão como indicadores.
   3. Placa de sementes com 50 μL de OP50 E. coli em apenas um lado da barreira de cobre para criar um gramado uniforme (Figura 2). A concentração bacteriana deve permanecer consistente em todos os ensaios; no entanto, pouca variabilidade foi observada em resposta a diferenças leves na concentração.
      1. Use as linhas marcadas na parte inferior da placa para garantir que as bactérias não entrem em contato com a solução de cobre. Desde que a solução de cobre reveste a borda da placa e forme uma barreira na linha média, transfira as bactérias para que a solução de cobre não entre em contato com a fonte de alimento.
   4. Marque um segundo conjunto de placas e não transfira nenhuma E. coli OP50 para elas (Figura 2). Essas placas servirão para avaliar o controle negativo. Essas placas também devem ter uma marcação em uma metade da placa para denotar a origem inicial da transferência.
   5. Deixe as bactérias secarem e incube as placas a 37 °C durante a noite. Certifique-se de que as manchas bacterianas não sejam perturbadas ao transferir para uma incubadora ou sala a 37 °C. Perturbações excessivas podem alterar a localização ou a forma do adesivo alimentar.
3. Ensaio de quimiotaxia
   1. Prepare uma solução de sulfato de cobre (II) 0,5 M antes do início do ensaio. Desde que 125 μL da solução sejam usados por placa, aumente esse volume dependendo do número de placas de ensaio usadas (por exemplo, 5 placas de ensaio, 625 μL).
   2. Pipetar 100 μL da solução de sulfato de cobre (II) na borda do ágar para criar uma barreira externa de cobre. A parte inferior marcada da placa deve servir de guia.
   3. Pipetar 25 μL da solução de sulfato de cobre (II) para criar uma barreira na linha média.
      1. Certifique-se de que a solução de sulfato de cobre (II) não entre em contato com o adesivo bacteriano. Use uma técnica manchada, pois as listras podem afetar a locomoção devido a reentrâncias / arranhões no ágar.
   4. Deixe a solução de cobre secar na placa. O período de tempo pode variar dependendo das condições da placa e do laboratório. Verifique visualmente o ressecamento a cada 5 minutos após a transferência.
      OBSERVAÇÃO: A solução de cobre apresenta uma tonalidade azulada e é facilmente identificável. Use um tecido de laboratório para enxugar levemente a solução perto da borda da placa para discernir o ressecamento.
   5. Pipetar 20 μL do pellet de minhoca do fundo do tubo para a metade livre de bactérias da placa de ensaio.
      1. Certifique-se de que 10 vermes sejam transferidos para a placa de ensaio. Se vermes extras foram incluídos acidentalmente, remova-os escolhendo com óleo de halocarbono para garantir que nenhuma bactéria seja adicionada ao prato. Cada ensaio deve ter um número consistente de nematóides durante o ensaio.
         OBSERVAÇÃO: Se poucos vermes forem transferidos durante os ensaios, aumentar o tamanho inicial da amostra mitigará as perdas potenciais durante as lavagens e transferências.
   6. Remova o excesso de M9 da placa com um lenço de laboratório. M9 não deve entrar em contato com a solução de sulfato de cobre (II).
      Cuidado: Certifique-se de que os vermes e a superfície do ágar não sejam afetados durante a execução desta etapa. Se usado com muita força, o tecido de laboratório pode criar reentrâncias na superfície do ágar da placa e remover vermes. Os worms removidos acidentalmente via KimWipe devem ser descartados.
   7. Uma vez que a solução M9 tenha sido removida e todos os vermes tenham iniciado padrões de locomotria não líquidos, inicie o cronômetro do ensaio.
      1. Idealmente, remova a solução M9 dentro de um minuto. O parâmetro essencial é a identificação da locomoção sinusoidal. Os vermes se locomovem de maneira diferente, por exemplo, debatendo-se em vez de sinusoidal, quando em líquido. Inicie o cronômetro do ensaio assim que cada um dos organismos experimentais parar de se debater.
   8. Verifique as placas de ensaio a cada 30 min.
      1. Para as placas de ensaio com manchas bacterianas, pontue positivamente os organismos se eles atingirem a mancha alimentar durante um período de 4 h. Para as placas de controle negativo, pontue positivamente os organismos se eles cruzaram a barreira.

Resultados

Figura 1: Uma representação visual de marcações para indicar a colocação de solução de cobre na parte inferior de uma placa de Petri de 5 cm. Essas indicações são usadas para garantir que as seções da placa tenham sido medidas adequadamente e servem como diretriz ao transferir o adesivo bacteriano e, em seguida, a solução de cobre para a superfície do ágar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
M9 Solução [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O para 1 litro. Autoclave para esterilizar antes do uso.]			Produzido em laboratório
Sulfato cúprico	sigma	C-1297	Use água para suspender adequadamente a uma concentração de 0,5 M