$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo é um trecho de Turek et al, Microcâmaras de agarose para imagens de cálcio de longo prazo de Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
1. Imagem de cálcio
- Use cepas transgênicas que expressam sensores de cálcio geneticamente codificados, como HBR16 (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
- Use um microscópio composto equipado para epifluorescência de campo amplo. Conecte a saída TTL da câmera EMCCD à entrada TTL do LED, de modo que cada vez que a câmera gravar um quadro, a amostra seja iluminada. Use um tempo de exposição de cerca de 5 mseg. Use o ganho EM na faixa de 50 a 300.
- Especifique um filme em sequência em execução por 24 horas com cada worm sendo fotografado a cada 15 - 30 minutos, primeiro por 20 segundos com DIC, depois por 20 segundos com uma fluorescência GFP para registrar GCaMP e, em seguida, tire uma imagem final do sinal mKate2 para controlar os níveis de expressão. Use uma taxa de quadros de 2/s durante cada intermitência.
- Para inspeção visual de dados, use um mapa de cores falsas para aumentar a visibilidade de pequenas mudanças na intensidade da fluorescência. Plote os dados fluorescentes como ΔF / F, sendo F o valor médio da linha de base da fluorescência. Uma descrição detalhada da análise dos dados de cálcio pode ser encontrada na literatura.