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Este protocolo foi extraído de Teoh et al, Abordagens quantitativas para estudar estruturas celulares e morfologia de organelas em Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Quantificando a estrutura muscular da parede corporal
- Imagem de fluorescência da estrutura muscular da parede corporal
- Obtenha uma cepa (por exemplo, RW1596) carregando o transgene stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)), que rotula fibras de miosina com GFP.
OBSERVAÇÃO: A introdução do transgene em animais pode ser alcançada cruzando uma cepa de interesse com animais que já expressam o transgene ou microinjetando DNA no braço distal da gônada. O fenótipo 'rolante' induzido pela mutação rol-6 neste transgene facilita a visualização dos músculos. Os músculos da parede corporal correm ao longo dos lados dorsal e ventral que normalmente são impedidos de serem vistos em animais selvagens porque normalmente se encontram em um de seus lados laterais. O alelo rol-6 (su1006) induz a torção dos animais, expondo assim algumas células musculares para imagens.
- Visualize os animais usando um microscópio de fluorescência acoplado a uma câmera de dispositivo acoplado carregado (CCD) de alta resolução, objetiva de 40X ou superior, filtro GFP e software de aquisição.
- Ajuste o tempo de exposição e a intensidade da iluminação para evitar imagens supersaturadas.
- Capture e salve imagens de músculos (ampliação de 400X) de uma seção do animal contendo pelo menos uma célula muscular oblíqua visível completa. Evite regiões com uma única célula muscular incompleta ou seções fora de foco. Excluem também imagens de regiões extremas anteriores e posteriores e regiões adjacentes à vulva.
OBSERVAÇÃO: Se o animal não tiver uma única célula muscular completa visível, deslize suavemente a lamínula para virar o animal de modo a expor uma célula completa.
- Medição da área das células musculares
- Abra a imagem no software Fiji (a versão 2.0.0 foi utilizada neste estudo).
- Use a seleção de polígonos para traçar cuidadosamente em torno de uma única célula muscular oblíqua. Ajuste a linha do polígono no final arrastando o ponto de âncora para melhorar o traçado.
- Vá para a guia Analisar na parte superior do software e clique em Medir para calcular a área da seleção. Uma tabela de resultados separada contendo a área e outras medições será mostrada. Se a medida de área estiver ausente na tabela de resultados, vá para Definir medidas na guia Analisar e verifique se a caixa de área está marcada. Da mesma forma, desmarque outras medidas que não são necessárias.
- Para células musculares com uma região degenerada/ausente, trace a região ausente com a ferramenta de seleção de polígonos e clique em Medir novamente. Se houver várias lacunas dentro da célula, trace cada lacuna separadamente.
- Calcule a proporção da área de lacuna para toda a célula muscular única. Uma proporção alta indica uma maior extensão da degeneração muscular devido a grandes lacunas dentro da célula. Se não houver regiões ausentes, como comumente visto em animais selvagens, a razão seria calculada como zero.
OBSERVAÇÃO: Como controle, pontue também visualmente os defeitos da estrutura muscular e compare os resultados com a medição quantitativa. Isso é especialmente útil se a cepa estiver sendo estudada pela primeira vez em laboratório. Para pontuação fenotípica, avaliar os animais como defeituosos ou não defeituosos com base na integridade dos filamentos. Por exemplo, animais com perda de estrias filamentares distintas, aglomeração de GFP ou lacunas nas células musculares devido à quebra estrutural seriam classificados como defeituosos.