Este protocolo é um trecho de Xu e Chisholm, Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).
1. Ferimento a laser
NOTA: Use irradiação a laser de femtossegundo (800 nm) para realizar ferimentos mais precisos.
- Prepare almofadas de ágar em uma lâmina de vidro com ágar 2% derretido. Certifique-se de que as almofadas sejam semelhantes às almofadas de ágar usadas para imagens ao vivo de C. elegans.
- Transfira 10 vermes adultos jovens para a almofada de agarose com picador de minhoca e adicione uma gota de 2 μl de solução de levamisol a 12 mM. Cubra os animais e o líquido com uma lamínula. Aguarde 1-2 minutos para que os vermes paralisem.
- Coloque a lâmina de vidro em um microscópio confocal de disco giratório. Mova o palco para encontrar os vermes e concentre-se na epiderme sincicial anterior ou posterior lateral com uma objetiva de 100X (NA 1,4-1,46).
- Defina a potência do laser de femtossegundo para 140 mW (medido antes da objetiva). Use o laser de femtossegundo a uma taxa de repetição de 80 MHz.
OBSERVAÇÃO: Dois pulsos de 200 ms cada (separados por 20 ms) são suficientes para ferir em nossas mãos.
- Concentre-se na superfície apical da célula epidérmica e enrole a epiderme. Observe a ruptura local do citoplasma (borbulhamento) ou o branqueamento local de qualquer marcador fluorescente usado.
OBSERVAÇÃO: Siga os procedimentos de segurança do laser apropriados ao usar o laser de femtossegundo. Varreduras de linha ou ponto usando lasers de femtossegundo, como os de dois microscópios de fótons, devem fornecer energia suficiente para a ferida a laser.
OBSERVAÇÃO: Embora não tenhamos experiência direta no uso de outros lasers, em princípio, o ferimento deve ser possível usando lasers UV convencionais (como usado em ablações de células de C. elegans). Opcionalmente, use um módulo de recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) no disco giratório confocal para ferir a epiderme (N. Pujol, comunicação pessoal).
