Alimentação com FITC-Dextrano: Um Método para Quantificar a Permeabilidade Intestinal em C. elegans

Resumo

Fonte: Le, T. A. N., et al. Medindo os efeitos de bactérias e produtos químicos na permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo apresenta um método para visualizar e medir a integridade do lúmen intestinal de C. elegans alimentando vermes com dextrana marcada com FITC. O protocolo de exemplo mostra o ensaio feito com vermes tratados com 3,3'-diindolilmetano (DIM) e alimentados com patógenos.

Protocolo

Este protocolo é um trecho de Le et al, Medindo os efeitos de bactérias e produtos químicos na permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Preparação de placas NGM para testar os efeitos de um produto químico (DIM) na permeabilidade intestinal de C. elegans alimentados com P. aeruginosa
   1. Adicione 0,5 g de peptona, 0,6 g de NaCl, 195 mL de água destilada, um agitador magnético e 6,8 g de ágar a uma garrafa de vidro de 500 mL (ágar NGM).
   2. Adicione 0,5 g de peptona, 0,6 g de NaCl, 195 mL de água destilada e um agitador magnético sem ágar a outra garrafa de vidro de 500 mL (caldo NGM).
   3. Autoclave os dois frascos (das etapas 1.1 a 1.2), um frasco de vidro vazio de 100 mL e um frasco de vidro vazio de 500 mL por 15 min a 121 °C. Em seguida, deixe o meio contendo garrafas esfriar até 55 °C em banho-maria por 30 min. Mantenha o meio de ágar-ágar no banho-maria e remova a garrafa contendo o caldo (da etapa 1.2) para a próxima etapa.
   4. Adicione os produtos químicos aditivos ao caldo NGM: 0,4 mL de 1 M CaCl₂, 0,4 mL de colesterol em etanol (mL), 0,4 mL de 1 M MgSO₄ e 10 mL de 1 M KPO₄ (todos esses componentes devem ser esterilizados além do colesterol em etanol). Em seguida, agitar bem a mistura com um agitador magnético a 55 °C.
   5. Rotule o frasco de vidro vazio autoclavado de 500 mL com dimetilsulfóxido (DMSO) e o frasco de vidro vazio autoclavado de 100 mL com DIM.
   6. Transfira 50 mL de caldo NGM para o frasco de 100 mL rotulado com DIM. Adicione 500 μL de estoque DIM de 20 mM no frasco e misture bem.
      NOTA: O DIM é dissolvido em DMSO (estoque DIM de 20 mM).
   7. Remova rapidamente o meio de ágar NGM do banho-maria, adicione 50 mL do meio de ágar NGM no frasco com rótulo DIM e misture bem.
   8. Colocar uma alíquota de 20 ml de meio NGM contendo DIM em cada placa de Petri de 90 mm x 15 mm. Aproximadamente cinco placas NGM contendo DIM podem ser feitas a partir desta etapa.
      NOTA: A concentração final de DIM em cada placa NGM será de 100 μM.
   9. Para preparar a placa NGM contendo DMSO, transfira 150 mL de caldo NGM para o frasco de 500 mL rotulado com DMSO. Adicione 1,5 mL de DMSO ao frasco e misture bem.
   10. Adicione 150 mL do meio de ágar NGM ao frasco rotulado com DMSO e misture bem.
   11. Colocar uma alíquota de 20 ml de meio NGM contendo DMSO em cada placa de Petri de 90 mm x 15 mm. Aproximadamente quinze placas NGM contendo DMSO podem ser feitas a partir desta etapa.
       NOTA: A concentração final de DMSO em cada placa NGM será de 0,5%.
   12. Solidificar as placas à temperatura ambiente durante pelo menos 3 h e armazená-las a 4 °C até à utilização.
       NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
   13. Retirar a cultura de E. coli OP50 ou P. aeruginosa PAO1 do frigorífico a 4 °C e vortex a cultura de forma adequada antes de espalhar para as placas NGM.
   14. Coloque 800 μL da cultura bacteriana de E. coli OP50 ou P. aeruginosa PAO1 em cada placa de ágar NGM fresca e deixe as placas secarem em uma incubadora a 20 °C durante a noite.
       NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Para o terceiro experimento (Figura 1), foram preparadas duas placas NGM contendo DMSO revestidas com E. coli OP50 viva, uma placa NGM contendo DMSO revestida com P. aeruginosa PAO1 viva e uma placa NGM contendo DIM revestida com P. aeruginosa PAO1 viva.
2. Tratamento de bactérias ou alimentação DIM e FITC-dextrana
   1. Incubar os ovos sincronizados com a idade a 20 °C durante 64 h em placas NGM suplementadas com E. coli OP50 viva como alimento.
   2. Lave a larva L4 sincronizada com a idade com tampão S e transfira-a (mais de aproximadamente 500 vermes) para as placas NGM de tratamento contendo diferentes bactérias e produtos químicos. Incubá-los a 20 °C por 48 h.
      NOTA: O tempo de tratamento pode variar de 24 a 72 h, de acordo com as bactérias e produtos químicos utilizados. O efeito terapêutico ou preventivo do DIM também pode ser avaliado pré-tratando os vermes com patógenos e, em seguida, tratando os vermes com DIM (o efeito terapêutico) ou pré-tratando os vermes com DIM e depois tratando com patógenos (o efeito preventivo).
   3. Para preparar as placas suplementadas com FITC-dextrano, misture 2 mL de E. coli OP50 inativada pelo calor com 4 mg de FITC-dextrana. Em seguida, divida 100 μL da mistura FITC-dextrana e E. coli OP50 em vinte placas de ágar NGM frescas (60 mm x 15 mm) e deixe as placas secarem por 1 h em uma bancada limpa.
      NOTA: A concentração final de FITC-dextrano em cada placa NGM será de 20 μg/mL.
   4. Preparar cinco placas NGM contendo E. coli OP50 sem FITC-dextrano para o tratamento de controlo do veículo. Para isso, divida 100 μL de E. coli OP50 inativada pelo calor em cada placa de ágar NGM fresca (60 mm x 15 mm) e deixe as placas secarem por 1 h em uma bancada limpa.
      NOTA: Para cada experimento independente, são necessárias quinze placas NGM suplementadas com FITC-dextrana e cinco placas NGM sem FITC-dextrano.
   5. Após 48 h de tratamento (a partir da etapa 2.2), lave os vermes com tampão S, transfira os vermes para as placas suplementadas com FITC-dextrano e as placas NGM sem FITC-dextrana e incube as placas durante a noite (14–15 h).
      NOTA: Para cada grupo de tratamento, são necessárias 5 réplicas de coloração FITC-dextrana (ou alimentação de controle do veículo).
   6. Lave as minhocas com tampão S e deixe-as rastejar na placa de ágar NGM fresca por 1 h.
      NOTA: Para cada experimento independente, são necessárias um total de 20 novas placas NGM. Nesta etapa, você pode usar a placa NGM suplementada sem ou com E. coli OP50.
   7. Adicione 50 μL de solução de formaldeído a 4% a cada poço de uma placa preta de fundo plano de 96 poços. Transfira aproximadamente 50 vermes de cada placa NGM para cada poço para medições de fluorescência. Após 1 a 2 min, remova completamente todo o formaldeído de cada poço e adicione 100 μL de meio de montagem para revestir os poços.
      NOTA: A solução de formaldeído (4%) é usada para imobilizar e consertar os vermes. Para cada grupo de tratamento, 5 poços (5 repetições) são usados para análise de imagem.
3. Aquisição de imagens de C. elegans com o sistema de imagem de opereta e determinação da permeabilidade intestinal medindo a captação de fluorescência FITC-dextrana
   OBSERVAÇÃO:A estereomicroscopia fluorescente pode ser usada para análise de imagem em vez do sistema de opereta.
   1. Capture imagens de fluorescência e meça a intensidade de fluorescência usando o Operetta High-Content Imaging System e analise as imagens com o software Harmony.
   2. No software Harmony, pressione o ícone Abra a tampa para abrir a tampa e colocar a placa na máquina.
   3. Configure os parâmetros.
   4. Clique em Configurar, selecione o tipo de placa (fundo plano de 96 poços) e adicione os canais (canais de campo claro e EGFP).
   5. Ajuste o layout. Vá para a seleção de layout e, em seguida, selecione Rastrear e ajuste os parâmetros (primeira imagem em 1 μm, o número de planos é 10, a distância é 1 μm).
   6. Selecione um dos poços de tratamento e um campo de captura e pressione Teste para verificar se as imagens são satisfatórias na seção Executar experimento.
   7. Se as imagens forem satisfatórias, volte para a seção Configuração e pressione o ícone Redefinir no final da tela. Em seguida, selecione todos os poços de destino e um número adequado de campos de captura.
   8. Vá para Executar experimento novamente e insira o nome da placa e pressione Iniciar para iniciar o processamento.
   9. Para medir a intensidade da fluorescência, vá para a seção de análise de imagem e insira a imagem. Encontre a célula escolhendo o canal EGFP e o método B. Ajuste o limite comum para 0,5, a área para >200 μm², o fator de divisão para 3,0, o limite individual para 0,18 e o contraste para mais de 0,18. Em seguida, calcule as propriedades de intensidade e escolha a média como saída. Pressione o ícone Aplicar para salvar a configuração.
   10. Vá para a seção Avaliação para medir a intensidade obtendo um mapa de calor e uma tabela de dados. Defina o parâmetro Readout para Cells — Intensity Cell EGFP Mean — Mean per Well e inicie a avaliação.
       NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
   11. Para extrair os dados da Opereta, clique no botão Configuração e escolha Gerenciamento de dados.
   12. Escolha Gravar arquivo e, em seguida, abra a navegação e selecione o arquivo.
   13. Para selecionar o arquivo, clique no pequeno sinal + no canto esquerdo e, em seguida, clique em Medição e escolha Nome da placa.
   14. Selecione o arquivo e clique em OK.
   15. Selecione o caminho para salvar o arquivo clicando no sinal Procurar no caminho ativo.
   16. Clique em Iniciar para salvar o arquivo de dados.
       NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
4. Análise Estatística da Fluorescência FITC-dextrana de C. elegans
   1. Importe os dados e calcule a média e o desvio padrão (DP) usando um software de estatística.
   2. Analise a diferença significativa com análise de variância (ANOVA) unidirecional seguida do teste de comparações múltiplas de Tukey.

Resultados

Figura 1: O efeito do DIM na permeabilidade intestinal de C. elegans alimentados com P. aeruginosa.Imagens microscópicas de vermes de (A) E. coli OP50 sem alimentação FITC-dextrana, (B) E. coli com alimentação FITC-dextrana, (C) P. aeruginosa ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3,3'-diindolilmetano	Sigma	D9568
90×15 mm Placas de Petri	SPL Life Sciences, Coreia do Sul	10090
Ágar Bactor	Beckton Dickinson	REFERÊNCIA 214010
Solução de formaldeído	sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Centro de Genética Caenorhabditis (CGC)		Tipo selvagem
Colesterol	sigma	C3045
Costa, 96 Poços Preto Com Fundo Plano Transparente Não Tratado, Sem Tampa Poliestireno	Corning Incorporada	REFERÊNCIA 3631
Dimetilsulfóxido	sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Centro de Genética Caenorhabditis (CGC)
Isotiocianato de fluoresceína - dextrano	sigma	FD10S
Software Harmony	PerkinElmer		versão 3.5
Sulfato de magnésio heptahidratado	Biorreagentes Fisher	BP2213-1
Fluoromount meio de montagem aquoso	sigma	Rolamento F4680
Operetta CLS Sistema de Análise de Alto Conteúdo	PerkinElmer	HH16000000
Peptona	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Coleção coreana para cultura de tipos	KCTC Nº 1637
Cloreto de sódio	Biorreagentes Fisher	BP358-1
Microscópio Estéreo	Nikon, Japão	SMZ800N