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O protocolo a seguir é um trecho de Farboud et al, Edição aprimorada do genoma com ribonucleoproteína Cas9 em diversas células e organismos, J. Vis. Exp.(2018).
1. Montagem RNP
- Projete o experimento com bastante antecedência, adquirindo todos os componentes de RNA, DNA e proteína com antecedência. Como primeira passagem, tente um dos controles positivos listados na Tabela 1 e use os reagentes comerciais descritos na Tabela de Materiais para garantir um projeto experimental confiável e a integridade dos materiais. Para obter dicas adicionais sobre como planejar um novo experimento de edição de genoma, consulte artigos sobre este tópico.
NOTA: Uma vez montados conforme descrito nas etapas subsequentes, os RNPs preparados com antecedência podem ser armazenados a -80 °C.
- Depois de escolher qual gene segmentar, use uma das ferramentas online gratuitas para projetar um gRNA ideal. Certifique-se de direcionar um exon se quiser gerar um nocaute.
OBSERVAÇÃO: Essas ferramentas ajudarão a identificar um local-alvo com uma sequência PAM de S. pyogenes adjacente, pontuação de alta qualidade e baixa pontuação fora do alvo.
- Purifique a proteína Cas9 de S. pyogenes por meio de métodos publicados ou compre-a de um fornecedor comercial.
- Prepare um tampão Cas9 típico para a diluição de RNA, preparação de RNP e armazenamento de proteínas, que contém 20 mM de HEPES pH 7,5, 150 mM de KCl, 10% de glicerol e 1 mM de TCEP. Sempre use água livre de nuclease em tampões que serão usados para ressuspender ou diluir o RNA para evitar a degradação.
- Produza o RNA guia (tracrRNA e crRNA ou sgRNA) por meio de uma transcrição in vitro usando métodos publicados ou compre-o de uma empresa de síntese de ácidos nucleicos.
- Se estiver inserindo um gene, sintetize ou compre um modelo de DNA do doador.
- Armazene as alíquotas de proteína e RNA a -80 °C e descongele no gelo imediatamente antes do uso.
NOTA: Cada congelamento e descongelamento diminui ligeiramente a eficiência. Protocolos detalhados e de acesso aberto para purificação de Cas9 e transcrição in vitro de sgRNAs estão disponíveis em outros lugares.
- Preparação de RNP para edição de C. elegans: Monte o complexo RNP adicionando os seguintes reagentes para criar um volume final de 20 μL (as concentrações finais são indicadas entre parênteses): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7,5 (10 μM), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM), e os modelos de reparo, se necessário (0,5 μM de ssDNA ou até 350 ng/μL de dsDNA).
NOTA: A eficiência de um reparo com modelo de DSB mediado por Cas9 é proporcional à concentração da construção de reparo de dsDNA; Assim, quanto maior a concentração do modelo de reparo, mais eficiente será o modelo de reparo. No entanto, uma injeção de misturas contendo mais de 350 ng/μL de dsDNA demonstrou reduzir a viabilidade dos vermes injetados. Assim, é melhor usar até, mas não mais do que 350 ng/μL de dsDNA na mistura para maximizar a eficiência do reparo e minimizar sua letalidade.
- Adicione vários crRNAs para atingir vários loci simultaneamente, conforme necessário para a abordagem de triagem de co-CRISPR/coconversão. Ao adicionar mais de um crRNA, adicione cada um sequencialmente à mistura principal.
NOTA: A quantidade de cada crRNA não precisa ser a mesma, e mesmo dobrar a concentração total de crRNAs no master mix sem alterar a concentração de Cas9 não parece interferir na frequência de mutagênese em um locus específico. Os exemplos são descritos em detalhes em Paix et al.
- Misture pipetando e gire a solução RNP a 16.000 x g por 5 s para garantir que a solução seja coletada no fundo do tubo.
- Incubar a solução a 37 °C durante 15 m.
- Centrifugue a amostra a 16.000 x g por 1 min para pellet quaisquer partículas que possam entupir a agulha de microinjeção de furo fino. Use o sobrenadante nas etapas subsequentes.
- Preparação de C. elegans
1. 1 dia antes da microinjeção: Prepare as almofadas de agarose para a microinjeção.
- Faça uma solução de agarose a 3% (p / v) em água adicionando agarose à água e levando a solução para ferver em uma placa quente ou no micro-ondas.
- Disponha as lâminas de vidro de cobertura de 24 mm x 50 mm x 1.5 mm em uma mesa e use uma pipeta de vidro Pasteur para colocar uma pequena gota (~ 15 μL) de solução de agarose na lâmina. Alise rapidamente a gota de agarose colocando outra lamínula por cima. Deixe a agarose solidificar e remova uma das lamínulas.
- Deixe a lamínula revestida de agarose voltada para cima sobre uma mesa durante a noite para secar. Após 24 h, armazene as almofadas de agarose em um recipiente limpo e seco.
OBSERVAÇÃO: Estes podem ser usados indefinidamente.
2. Puxe as agulhas de microinjeção: utilizando capilares de vidro borossilicato com filamentos (diâmetro externo 1,0 mm e diâmetro interno 0,58 mm), puxe as agulhas à base de Mello e Fire57 e outros recursos. As agulhas podem ser usadas imediatamente ou podem ser armazenadas em um recipiente limpo e seco, apoiado por suportes de argila.
3. Para a manutenção dos vermes, prepare um ágar Nematoid Growth Media (NGM) derramado em placas de Petri e manchado com bactérias OP50 (para protocolos de manutenção padrão de C. elegans e receitas para meios de crescimento, consulte Stiernagle).
4. Prepare os vermes para microinjeção: 12-24 h antes da microinjeção, escolha hermafroditas com estágio L4 em uma nova placa de ágar-NG com bactérias OP50 e incube-os durante a noite a 20 ° C. Para cada mistura de alvo / injeção Cas9, escolha ~ 30 vermes para a placa.
- Dia da microinjeção: Carregue a agulha de microinjeção puxada com o sobrenadante da solução RNP preparado na etapa 1.2.
- Pipetar o sobrenadante do passo 1.2.4 para uma pipeta capilar puxada e preencher a solução da pipeta capilar para a agulha de microinjeção preparada (geralmente carregando menos de 0,1 μL).
- Monte a agulha carregada no aparelho de microinjeção conectado a um micromanipulador. Ajuste a pressão do aparelho de injeção para 250 kPa e a pressão de equilíbrio para 25 kPa.
- Quebre a ponta da agulha carregada para gerar uma borda afiada da agulha. Coloque uma lamínula quadrada de 15 mm x 15 mm x 1,5 mm na parte superior de uma lamínula de 24 mm x 50 mm x 1,5 mm.
- Sobreponha uma borda da lamínula quadrada com óleo de halocarbono 700.
- Posicionar a agulha no óleo, no bordo da lamínula quadrada de 15 mm.
- Usando uma mão para guiar o microscópio stage e lamínula, escove a lâmina para cima e ao longo da borda da agulha enquanto pressiona o pedal/botão de injeção. Quebre a ponta da agulha para trás, aumentando o fluxo do líquido para fora da agulha. Obtenha uma taxa de fluxo ideal fazendo com que a mistura de injeção flua ao longo da borda da agulha, formando ~ 1 bolha / s.
- Confirme se os vermes L4 colhidos 12-24 h antes da microinjeção são adultos jovens em estágio de desenvolvimento no dia da injeção. Escolha os vermes adultos jovens em uma placa de ágar NG que não tenha bactérias OP50 e deixe-os rastejar por 5 minutos. Isso reduz a quantidade de bactérias transferidas para a almofada de injeção, minimizando os entupimentos da agulha.
- Coloque uma almofada/lamínula de injeção de agarose em um escopo de dissecação. Usando uma picareta de minhoca, coloque uma pequena faixa de óleo de halocarbono ao longo de uma borda da almofada.
- Usando o picareta de minhoca revestido com óleo, levante vários sem-fim da placa de ágar-NG e coloque-os no rastro de óleo. Com um cabelo fino preso a uma pipeta, como um cílio ou bigode de gato, posicione os vermes em paralelo, empurrando-os suavemente para dentro da almofada de agarose. Até se sentir confortável com o procedimento de microinjeção, monte e injete apenas um verme de cada vez.
NOTA: A agarose seca absorverá a umidade dos vermes, fazendo com que eles adiram à almofada. Consequentemente, deve-se trabalhar rapidamente, pois os vermes podem desidratar.
- Uma vez na posição e presa à almofada, cubra as minhocas com mais algumas gotas de óleo de halocarbono (~ 20 μL) da ponta da picareta de minhoca.
- C. elegans Microinjeção de Gônadas com RNPs e Cuidados Pós-Injeção
O protocolo de microinjeção é adaptado de Mello e Fire e descrito em detalhes em outro artigo.
- Coloque a lamínula com os sem-fins montados no microscópio de injeção. Sob uma ampliação baixa (objetiva de 5X, ocular de 10X), posicione os vermes perpendicularmente à agulha de injeção.
- Mude para uma ampliação alta (objetiva de 40X, ocular de 10X), reposicione a agulha adjacente ao braço da gônada correspondente à região próxima aos núcleos no paquiteno médio a tardio.
- Usando o micromanipulador, mova a agulha contra o verme, pressionando levemente a cutícula. Em seguida, com uma mão, bata na lateral do estágio do microscópio para sacudir a agulha através da cutícula. Pressione o pedal/botão de injeção e encha lentamente o braço da gônada com a mistura de injeção e remova a agulha.
- Repita esta etapa com o outro braço da gônada.
- Depois que os vermes forem injetados, remova a lamínula / almofada de agarose e coloque-a sob um microscópio de dissecação.
- Usando uma pipeta capilar puxada, desloque o óleo dos vermes pipetando um tampão M9 sobre eles. Realize este tratamento para liberar os vermes do ágar.
- Após 10 min, quando os vermes estiverem se debatendo no tampão, mova-os para uma placa de ágar-NG com bactérias OP50 usando a pipeta capilar puxada. Colocar a placa a 20 °C durante 2-3 h até que as minhocas tenham recuperado e estejam a deslocar-se.
- Uma vez recuperados, transferir individualmente os vermes para placas de ágar-GN com OP50 e transferir as placas para uma incubadora a 25 °C.
- Deixe os vermes injetados com P 0 crescerem e colocarem progênie por 3 dias. Rastreie a prole F 1.
- Se estiver usando co-CRISPR ou co-conversão, selecione os vermes candidatos para triagem com base no fato de eles terem o fenótipo mutante do gene de referência. Transfira individualmente esses vermes marcados para novas placas de ágar-NG com OP50 e deixe-os colocar a progênie F2 a 20 ° C.
OBSERVAÇÃO: O fenótipo usado para uma triagem ou seleção de co-CRISPR deve fornecer uma estimativa inicial para o sucesso da edição de Cas9.
- Se o fenótipo co-CRISPR não estiver presente, microinjete um plasmídeo de controle positivo para ajudar a melhorar a eficiência da microinjeção.
OBSERVAÇÃO: Por exemplo, incluir um plasmídeo na mistura de injeção que codifica o MYO-2 marcado com mCherry ajudará a avaliar a eficiência da injeção. Os vermes injetados com sucesso com pCFJ90 terão alguns descendentes com faringes fluorescentes.
- Examine os vermes F1 quanto à presença das edições desejadas. Escolha a mãe F1 para um poço individual de uma placa de 96 poços, lise-a e examine seu DNA por amplificação de PCR específica para inserção, análise de sequência de DNA ou ensaio de nuclease do agrimensor (CEL-1).
OBSERVAÇÃO: Esses ensaios podem ser realizados ao usar um co-CRISPR/coconversão ou outros regimes de triagem ou seleção.
