गोनाड माइक्रोइंजेक्शन: सी एलिगेंस के जर्मलाइन में सीधे यौगिक वितरण की एक विधि

Overview

यह वीडियो माइक्रोइंजेक्शन का वर्णन करता है, ट्रांसजेनिक सी एलिगेंस उपभेदों को बनाने का एक आम तरीका है।  उदाहरण में, हम देखेंगे कि CRISPR-आधार जीन संपादन के लिए एक राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) परिसर पेश करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग किया जाता है।

Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल फारबोड एट अल,संवर्धित जीनोम संपादन से विविध कोशिकाओं और जीवों, जे विस एक्सपी (2018) में Cas9 रिबोन्यूक्लियोप्रोटीनके साथ एक अंश है।

1. आरएनपी विधानसभा

1. प्रयोग को पहले से अच्छी तरह से डिजाइन करें, समय से पहले सभी आरएनए, डीएनए और प्रोटीन घटकों को प्राप्त करें। पहले पास के रूप में, तालिका 1 में सूचीबद्ध सकारात्मक नियंत्रणों में से एक की कोशिश करें और एक विश्वसनीय प्रयोगात्मक डिजाइन और सामग्री की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए सामग्री की तालिका में वर्णित वाणिज्यिक अभिकर्षकों का उपयोग करें। एक नए जीनोम संपादन प्रयोग की योजना बनाने पर अतिरिक्त सुझावों के लिए, इस विषय पर कागजात देखें ।
   नोट: एक बार बाद के चरणों में वर्णित के रूप में इकट्ठे हुए, अग्रिम में तैयार आरएनपी को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
   1. चुनने के बाद जो जीन को लक्षित करने के लिए, एक इष्टतम gRNA डिजाइन करने के लिए मुफ्त ऑनलाइन उपकरणों में से एक का उपयोग करें । नॉकआउट उत्पन्न करने की उम्मीद कर रहे हैं तो एक एक्सपर को लक्षित करना सुनिश्चित करें।
      नोट: ये उपकरण एक आसन्न एस पायोजेन्स पाम अनुक्रम, उच्च गुणवत्ता वाले स्कोर और कम ऑफ-टारगेट स्कोर के साथ एक लक्ष्य साइट की पहचान करने में मदद करेंगे।
   2. प्रकाशित तरीकों के माध्यम से एस पायोजीन्स Cas9 प्रोटीन को शुद्ध करें या इसे वाणिज्यिक विक्रेता से खरीदें।
   3. आरएनए कमजोर पड़ने, आरएनपी तैयारी और प्रोटीन स्टोरेज के लिए एक विशिष्ट Cas9 बफर तैयार करें, जिसमें एचईपी पीएच 7.5 के 20 mm, केसीएल के 150 mM, 10% ग्लाइसरोल और 1 mm TCEP शामिल हैं। हमेशा बफ़र्स में नाभिक मुक्त पानी का उपयोग करें जिसका उपयोग गिरावट को रोकने के लिए आरएनए को फिर से रीस्ड या पतला करने के लिए किया जाएगा।
   4. प्रकाशित तरीकों का उपयोग करके इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से गाइड आरएनए (ट्रेसरएनए और सीआरएनए या एसजीआरएनए) का उत्पादन करें, या इसे न्यूक्लिक एसिड संश्लेषण कंपनी से खरीदें।
   5. यदि एक जीन डालने, संश्लेषण या एक दाता डीएनए टेम्पलेट खरीद ।
   6. प्रोटीन और आरएनए एलिकोट्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और उपयोग से तुरंत पहले बर्फ पर गल जाएं।
      नोट: प्रत्येक फ्रीज-गल दक्षता को थोड़ा कम करता है। Cas9 शुद्धिकरण के लिए विस्तृत, ओपन-एक्सेस प्रोटोकॉल और एसजीआरएनए के इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन कहीं और उपलब्ध हैं।
2. सी के लिए आरएनपी तैयारी एलिगेंस एडिटिंग: 20 माइक्रोन की अंतिम मात्रा बनाने के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों को जोड़कर आरएनपी परिसर को इकट्ठा करें (अंतिम सांद्रता कोष्ठक में नोट की जाती है): कैस9 (2 माइक्रोन), एचईपीएस पीएच 7.5 (10 माइक्रोन), केसीएल (115 माइक्रोन), सीआरआरएनए (12 माइक्रोन), ट्रेसरएनए (40 माइक्रोन), और मरम्मत टेम्पलेट्स यदि आवश्यक हो (0.5 माइक्रोन एसडीडीएन या 350 एनजी/μL dsDNA तक)।
   नोट: Cas9-मध्यस्थता डीएसबी-टेम्पलेट्ड मरम्मत की दक्षता डीएसडीएनए मरम्मत निर्माण की एकाग्रता के आनुपातिक है; इस प्रकार, मरम्मत टेम्पलेट की एकाग्रता जितनी अधिक होगी, टेम्पलेट की मरम्मत उतनी ही अधिक कुशल होगी। हालांकि, इंजेक्शन कीड़े की व्यवहार्यता को कम करने के लिए डीएसडीएनए के 350 एनजी/μL से अधिक घोला जा सकता है। इस प्रकार, इसकी घातकता को कम करते हुए मरम्मत दक्षता को अधिकतम करने के लिए मिश्रण में डीएसडीएनए के 350 एनजी/μL से अधिक उपयोग करना सबसे अच्छा है।
   1. सह-CRISPR/सह-रूपांतरण स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के लिए आवश्यक के रूप में, एक साथ कई लोकी को लक्षित करने के लिए कई crRNAs जोड़ें । एक से अधिक crRNA जोड़ते समय, प्रत्येक क्रमिक रूप से मास्टर मिश्रण में जोड़ें।
      नोट: प्रत्येक सीआरएनए की मात्रा समान होने की आवश्यकता नहीं है, और यहां तक कि Cas9 की एकाग्रता को बदले बिना मास्टर मिश्रण में सीआरआरएन की कुल एकाग्रता को दोगुना करने से एक विशिष्ट लोकस पर म्यूटेनेसिस की आवृत्ति में हस्तक्षेप नहीं होता है। पैक्स एट अल में उदाहरणों का विस्तार से वर्णन किया गया है।
   2. पाइपिंग द्वारा मिलाएं और 5 एस के लिए 16,000 x ग्राम पर आरएनपी समाधान को स्पिन करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि समाधान ट्यूब के नीचे एकत्र किया गया है।
   3. 15 मीटर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान इनक्यूबेट करें।
   4. 1 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर नमूना अपकेंद्रित्र करें ताकि किसी भी कण को गोली दी जा सके जो पतली ऊब वाली माइक्रोइंजेक्शन सुई को रोक सकता है। बाद के चरणों में सुपरनिट का उपयोग करें।
3. C. एलिगेंस तैयारी

1. माइक्रोइंजेक्शन से 1 दिन पहले: माइक्रोइंजेक्शन के लिए एगरेग्लेड पैड तैयार करें।

1. पानी में एगरेग डालकर पानी में 3% (w/v) एगरेज सॉल्यूशन बनाएं और घोल को गर्म प्लेट पर या माइक्रोवेव में उबाल लाएं ।
2. एक टेबल पर 24 मिमी x 50 मिमी x 1.5 मिमी कवर ग्लास स्लाइड की व्यवस्था करें और स्लाइड पर एगर उठे समाधान की एक छोटी (~ 15 माइक्रोएल) बूंद रखने के लिए ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। शीर्ष पर एक और कवरलिप रखकर एगरेग ड्रॉप को जल्दी से समतल करें। एगरे को जमना और फिर एक कवरस्लिप को हटाने की अनुमति दें।
3. सूखने के लिए रात भर टेबलटॉप पर एगर उठे-लेपित कवरस्लिप फेस-अप को छोड़ दें। 24 घंटे के बाद, एग्राजिंग पैड को एक साफ, सूखे कंटेनर में स्टोर करें।
   नोट: इनका उपयोग अनिश्चित काल तक किया जा सकता है।

2. माइक्रोइंजेक्शन सुइयों को खींचें: फिलामेंट्स (बाहरी व्यास 1.0 मिमी और आंतरिक व्यास 0.58 मिमी) के साथ बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं का उपयोग करके, मेलो और फायर⁵⁷ और अन्य संसाधनों के आधार पर सुइयों को खींचें। सुइयों का तुरंत उपयोग किया जा सकता है या मिट्टी के समर्थन से बंधने वाले एक साफ, सूखे कंटेनर में संग्रहीत किया जा सकता है।

3. कीड़े के रखरखाव के लिए, पेट्री प्लेटों में डाला गया एक नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) एगर तैयार करें और OP50 बैक्टीरिया के साथ देखा (मानक सी एलिगेंस रखरखाव और विकास मीडिया के लिए व्यंजनों पर प्रोटोकॉल के लिए, Stiernagle देखें)।

4. माइक्रोइंजेक्शन के लिए कीड़े को स्टेज करें: माइक्रोइंजेक्शन से पहले 12-24 घंटे, ओपी50 बैक्टीरिया के साथ एक नई एनजी-एगर प्लेट में एल 4-मंचन हर्मेफ्रोडाइट्स चुनें और उन्हें रात भर 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। प्रत्येक Cas9 लक्ष्य/इंजेक्शन मिश्रण के लिए, थाली के लिए ~30 कीड़े उठाओ ।

4. माइक्रोइंजेक्शन का दिन: कदम 1.2 में तैयार आरएनपी समाधान सुपरनेटेंट के साथ खींचा माइक्रोइंजेक्शन सुई लोड करें।
   1. स्टेप 1.2.4 से सुपरनेट को एक खींचा हुआ केशिका पिपेट में पिपेट करें और केशिका पिपेट से समाधान को तैयार माइक्रोइंजेक्शन सुई में बैकफिल करें (आमतौर पर 0.1 माइक्रोल से कम लोड हो रहा है)।
5. एक माइक्रोमैनीपुलेटर से जुड़े माइक्रोइंजेक्शन उपकरण पर लोडेड सुई माउंट करें। इंजेक्शन उपकरण दबाव 250 kPa और शेष दबाव 25 kPa करने के लिए सेट करें।
6. एक तेज सुई धार उत्पन्न करने के लिए भरी हुई सुई टिप वापस तोड़ें। 24 मिमी x 50 मिमी x 1.5 मिमी कवरलिप के शीर्ष पर 15 मिमी x 15 मिमी x 1.5 मिमी वर्ग कवरलिप रखें।
   1. प्रभामंडल तेल 700 के साथ वर्ग कवरलिप के एक किनारे को ओवरले करें।
   2. 15 मिमी वर्ग कवरलिप के किनारे पर, तेल में सुई की स्थिति।
   3. माइक्रोस्कोप चरण और कवरस्लिप गाइड करने के लिए एक हाथ का उपयोग करना, इंजेक्शन पेडल/बटन को निराशाजनक करते हुए स्लाइड को और सुई के किनारे के साथ ब्रश करें । सुई टिप को वापस तोड़ें, सुई से तरल के प्रवाह को बढ़ाते हैं। इंजेक्शन मिश्रण सुई के किनारे के साथ प्रवाह बनाने के द्वारा एक इष्टतम प्रवाह दर प्राप्त करें, ~1 बुलबुला/
7. पुष्टि करें कि L4 कीड़े माइक्रोइंजेक्शन से पहले 12-24 घंटे उठाया विकास इंजेक्शन के दिन युवा वयस्कों का मंचन कर रहे हैं । युवा वयस्क कीड़े को एनजी-एगर प्लेट में चुनें जिसमें OP50 बैक्टीरिया का अभाव है और उन्हें 5 मिनट तक क्रॉल करने की अनुमति है। यह इंजेक्शन पैड में स्थानांतरित बैक्टीरिया की मात्रा को कम करता है, सुई मोज़री को कम करता है।
8. एक विच्छेदन गुंजाइश पर एक agarose इंजेक्शन पैड/कवरलिप रखें । एक कीड़ा लेने का उपयोग करना, पैड के एक किनारे के साथ हेलोकार्बन तेल का एक छोटा सा ट्रैक रखना ।
9. तेल में लेपित कीड़ा लेने का उपयोग करना, एनजी-आगर प्लेट से और तेल के ट्रैक में कई कीड़े उठा । एक पिपेट से जुड़े एक ठीक बालों के साथ, जैसे कि एक बरौनी या बिल्ली मूंछ, समानांतर में कीड़े की स्थिति, धीरे से एग्राजिंग पैड में कीड़े को धक्का। माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया के साथ आरामदायक होने तक, केवल एक समय में एक कीड़ा माउंट और इंजेक्ट करें।
   नोट: सूखी एगर उठे कीड़े से नमी बाती करेंगे, जिससे उन्हें पैड का पालन करना होगा। नतीजतन, किसी को जल्दी से काम करना चाहिए क्योंकि कीड़े कम कर सकते हैं।
   1. एक बार स्थिति में और पैड से जुड़ा हुआ, कीड़े लेने की नोक से हेलोकार्बन तेल (~ 20 माइक्रोल) की एक और कुछ बूंदों के साथ कीड़े को ओवरले करें।
10. आरएनपीएस और पोस्ट-इंजेक्शन केयर के साथ सी एलिगेंस गोनाड माइक्रोइंजेक्शन
    माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल मेलो और फायर से अनुकूलित किया गया है और कहीं और विस्तार से वर्णित है।
    1. इंजेक्शन माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार कीड़े के साथ कवरस्लिप रखें। कम आवर्धन (5X उद्देश्य, 10X नेत्र) के तहत, इंजेक्शन सुई के लंबवत कीड़े की स्थिति।
       1. एक उच्च आवर्धन (40X उद्देश्य, 10X नेत्र) पर स्विच करें, मध्य-से-देर-pachytene में नाभिक के पास क्षेत्र के अनुरूप गोनाड हाथ से सटे सुई को फिर से स्थान दें।
       2. माइक्रोमैनिपलेटर का उपयोग करके, सुई को कीड़े के खिलाफ ले जाएं, क्यूटिकल को थोड़ा निराशाजनक करें। फिर, एक हाथ से, माइक्रोस्कोप चरण के किनारे टैप करें ताकि क्यूटिकल के माध्यम से सुई को झटका दिया जा सके। इंजेक्शन पेडल/बटन दबाना और धीरे-धीरे इंजेक्शन मिक्स के साथ गोनाड आर्म भरकर सुई निकाल दें।
       3. इस स्टेप को दूसरे गोनाड आर्म से दोहराएं।
    2. एक बार कीड़े इंजेक्शन हैं, कवरस्लिप/agarose पैड को हटा दें और इसे एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें ।
       1. एक खींचा केशिका पिपेट का उपयोग करके, उन पर M9 बफर को पिपिंग करके कीड़े से तेल को विस्थापित करें। आगर से कीड़े को छोड़ने के लिए यह उपचार करें।
       2. 10 मिनट के बाद, जब कीड़े बफर में चारों ओर पिटाई कर रहे हैं, उन्हें खींच लिया केशिका पिपेट का उपयोग कर OP50 बैक्टीरिया के साथ एक एनजी-agar प्लेट में ले जाएं । प्लेट को 2-3 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि कीड़े ठीक न हो जाएं और इधर-उधर घूम न जाएं।
    3. एक बार बरामद होने के बाद, व्यक्तिगत रूप से कीड़े को OP50 के साथ एनजी-एगर प्लेटों में स्थानांतरित करें और प्लेटों को 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
    4. पी₀- इंजेक्शनकीड़े को बढ़ने और 3 दिनों के लिए संतान रखने की अनुमति दें। एफ₁ संतानों को स्क्रीन करें।
       1. यदि सह-CRISPR या सह-रूपांतरण का उपयोग कर रहे हैं, तो उम्मीदवार कीड़े को स्क्रीनिंग के लिए चुनें कि क्या उनके पास संदर्भ जीन का उत्परिवर्ती फेनोटाइप है। व्यक्तिगत रूप से इन चिह्नित कीड़े को OP50 के साथ नए एनजी-एगर प्लेटों में स्थानांतरित करें और उन्हें₂₀ डिग्री सेल्सियस पर एफ 2 संतान बिछाने की अनुमति दें।
          नोट: सह-CRISPR स्क्रीनिंग या चयन के लिए उपयोग किए जाने वाले फेनोटाइप को Cas9 संपादन की सफलता के लिए एक प्रारंभिक अनुमान प्रदान करना चाहिए।
       2. यदि सह-CRISPR फेनोटाइप मौजूद नहीं है, तो माइक्रोइंजेक्शन दक्षता में सुधार करने में सहायता करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण प्लाज्मिड को माइक्रोइंजेक्ट करें।
          नोट: उदाहरण के लिए, इंजेक्शन मिश्रण में एक प्लाज्मिड सहित जो रीचेरी-टैग किए गए MYO-2 को इंजेक्शन दक्षता का आकलन करने में मदद करेगा। PCFJ90 के साथ सफलतापूर्वक इंजेक्शन वाले कीड़े फ्लोरोसेंट फरीनेक्स के साथ कुछ संतान होंगे।
    5. वांछित संपादन की उपस्थिति के लिए एफ₁ कीड़े की जांच करें। एफ₁ मां को एक ९६-अच्छी थाली के एक व्यक्ति को अच्छी तरह से उठाओ, उसे lyse, और या तो डालने के द्वारा उसके डीएनए की जांच-विशिष्ट पीसीआर प्रवर्धन, डीएनए अनुक्रम विश्लेषण, या सर्वेक्षक नाभिक परख (CEL-1) ।
       नोट: सह-CRISPR/सह-रूपांतरण या अन्य स्क्रीनिंग या चयन व्यवस्थाओं का उपयोग करते समय ये परखें की जा सकती हैं ।

Representative Results

तालिका 1: प्रारंभिक जीनोम संपादन प्रयोगों के लिए सकारात्मक नियंत्रण। यह तालिका इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रत्येक कोशिकाओं और जीवों में पहली बार जीनोम संपादन प्रयोग करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण जानकारी दिखाती है। इन मापदंडों के बाद एक सफल परिणाम है कि प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए या तुलना के लिए एक आधार रेखा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है एक बार प्रयोगकर्ता अपने स्वयं के हित के एक जीन को लक्षित कर रहा है उपज की संभावना है । एफ: फॉरवर्ड, आर: रिवर्स, एचडीआर: होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत। कृपया इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar