Irradiação UV: Um Método para Integrar Arranjos Extracromossômicos

Resumo

Fonte: Mariol, M. C et al. Um Protocolo Rápido para Integração de Matrizes Extracromossômicas com Alta Taxa de Transmissão no Genoma de C. elegans.J. Vis. Exp.(2013).

A microinjeção de transgenes geralmente resulta em cepas de C. elegans com grandes matrizes extracromossômicas, que resultam em expressão e transmissão variáveis do transgene. A irradiação UV pode induzir a integração cromossômica da matriz e uma transmissão transgênica mais estável.

Protocolo

Este protocolo é um trecho de Mariol et al, Um Protocolo Rápido para Integração de Matrizes Extracromossômicas com Alta Taxa de Transmissão no Genoma de C. elegans, J. Vis. Exp.(2013).

1. Irradiação UV e Recuperação de Vermes Transgênicos

1. Irradiação de vermes:
   1. Escolha 30-100 animais transgênicos fluorescentes L4 em placas de cultura separadas (15-20 animais por placa).
   2. Coloque as placas, com as tampas removidas, em um reticulador UV. Irradiar os vermes a 0,012 J/cm². Observe que as cepas são mais ou menos sensíveis aos raios UV e que os resultados podem variar dependendo do irradiador UV usado. Pode ser testada uma gama de doses entre 0,010-0,015 J/^cm2.
2. Recuperação de vermes após irradiação:
   1. Coloque as placas com vermes irradiados durante a noite a 15 °C para recuperação.
   2. Verifique o número de animais que estão vivos. Em nossas mãos, uma taxa de sobrevivência de cerca de 80-90% é adaptada para uma irradiação eficiente.
   3. Cultivar os animais irradiados a 15-25 °C até que a progenitura atinja a fase de desenvolvimento, permitindo observar a expressão do marcador de coinjecção.

2. Isolamento de Linhagens Transgênicas Integradas

1. Seleção de animais F1:
   1. Um único animal F1 fluorescente 150-200 em placas de cultura separadas. Para linhas altamente transmissoras (≥80%), 100 animais F1 são suficientes.
   2. Manter estas placas F1 a 15-25 °C até que a progenitura atinja uma fase adequada para a observação de animais fluorescentes F2.
   3. Rejeitar todas as placas F1 que apresentem i) ausência de progenitura, indicando que o animal F1 era estéril ou morreu, ou ii) ausência ou apenas alguns animais fluorescentes F2, indicando que o animal F1 não transmitiu o transgene à taxa esperada. Esta etapa é rápida e representa uma vantagem real quando comparada ao protocolo padrão que requer uma estimativa da porcentagem de vermes fluorescentes F2 para selecionar placas F1 exibindo ≥75% de progênie fluorescente (Tabela 1).
2. Seleção de animais F2:
   1. Um único quatro animais F2 transgênicos fluorescentes de cada placa F1 selecionada. Ao usar transgenes fluorescentes (por exemplo, mCherry, gfp ou dsRed), escolha vermes F2 com alto nível de fluorescência, pois isso pode indicar que esses animais são homozigotos para a matriz integrada. Observe que, ao escolher animais F2, é fundamental não carregar ovos ou larvas, a fim de evitar falsos negativos na próxima etapa.
   2. Cultive animais F2 a 15-25 °C.
3. Isolamento e validação de cepas transgênicas integradas:
   1. Filtre as placas F2 para vermes F3 transgênicos 100% fluorescentes. A tela é bastante rápida, pois a presença de um único verme não fluorescente indica que a placa deve ser jogada fora. Um animal homozigoto F2 para o transgene integrado dará uma progênie fluorescente 100% homozigótica.
   2. Oito animais fluorescentes F3 de placas selecionadas para confirmar a herança de 100% do transgene. Em teoria, escolher um animal é suficiente nesta etapa. No entanto, a escolha de oito animais fluorescentes F3 pode ser necessária para evitar a seleção de animais não férteis ou insalubres, pois a irradiação pode induzir aleatoriamente mutações que afetam genes importantes para a fisiologia do verme.
   3. Se possível, manter várias estirpes transgénicas integradas independentes, ou seja, estirpes recuperadas de diferentes animais F1.

Resultados

Tabela 1. Comparação dos protocolos padrão e aprimorados para integração de matrizes extracromossômicas no genoma de C. elegans.Dois transgenes não integrados transmitindo aproximadamente na mesma frequência foram integrados usando o protocolo padrão ou aprimorado. A principal diferença reside no fato de que no protocolo padrão é realizada uma triagem da progêni...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
U.V. reticulador	Fischer Scientific		Comprimento de onda 254 nm
Microscópio SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
placas de Petri, 60 mm	Cml	BPS55E6
Fio de platina 0,25 mm	Alfa Aesar	04/06/7440	Para fazer uma picareta para minhocas