Ensayo de captura de presas: un método para estudiar el comportamiento de captura de presas de larva de pez cebra

Overview

Este video describe el ensayo de captura de presas. El video analiza el método para estudiar el comportamiento de captura de presas de larvas de pez cebra después de la ablación láser de neuronas específicas.

Protocol

1. Evaluación de las consecuencias conductuales tras la ablación láser

1. Configure un sistema de grabación conductual que consista en un estereoscopio equipado con una cámara de vídeo. Utilice una cámara con un software de adquisición de imágenes adecuado, comercial o hecho a medida (Figura 1A).
2. Optimice la condición de iluminación para que el paramecium pueda ser detectado por el procesamiento de imágenes. Por ejemplo, utilice una luz LED blanca de anillo con un espaciador (Figura 1B).
   Nota: La distancia desde, y el ángulo de, el LED afecta a la apariencia de la muestra(es decir,brillante en fondo oscuro u oscuro en fondo brillante) y son, por lo tanto, críticos para el procesamiento exitoso de imágenes. Determinar la mejor altura del espaciador (Figura 1C).
3. Coloque una larva de pez cebra (recuperada del experimento de ablación láser descrito en la Sección 1) en una cámara de grabación conductual (que estaba unida a una diapositiva de vidrio) con el sello superior original eliminado(Figura 1D).
4. Recoge 50 paramecias suspendidas en agua del vaso de precipitados usando un micropipette y colócalos en la cámara de grabación.
5. Coloque un resbalón de cubierta en la parte superior de la cámara de grabación. Coloque una pequeña gota de agua en el resbalón de la cubierta antes de colocarla en la superficie del agua de la cámara de grabación para evitar introducir aire en la cámara.
   Nota: En este paso, un poco de agua con paramecia se desbordará de la cámara de grabación. El número restante de paramecia en la cámara de grabación será de aproximadamente 30-40.
6. Coloque la cámara de grabación (que contiene una larva y paramecia)en el sistema de iluminación (Figura 1D).
7. Inicie la grabación de lapso de tiempo a 10 fps durante 11 min (6.600 fotogramas).
8. (Opcional) Para cada larva que fue probada para el comportamiento, observe la fluorescencia de las áreas abladas por láser mediante microscopía fluorescente para confirmar la eficacia de la ablación con láser(es decir,ausencia, o número significativamente reducido de, células fluorescentes en el área irradiada por láser).
   Nota: Incluso después de la irradiación, algunas células fluorescentes todavía se pueden observar debido a la aparición posterior de la expresión génica de Gal4 en células que se diferenciaron después de la ablación.
9. Después de registrar el comportamiento de la larva, para compensar la falta de uniformidad en el fondo, realice una división píxel por píxel de cada fotograma por una imagen promedio en Fiji: haga clic en "Proceso", "Calculadora de imágenes", "Operación: Dividir", 'Resultado de 32 bits (flotador)' y 'Aceptar'. Para realizar una imagen media, haga clic en 'Imagen', 'Pilas', 'Proyecto Z', 'Intensidad media' y 'Aceptar' (Figura 1E, F).
10. Cuente el número de paramecias que quedan en la cámara haciendo clic en "Analizar", "Analizar partículas", estableciendo un rango de área que cubra toda la paramecia,marcando la casilla de verificación "Mostrar:Máscaras" y haciendo clic en "Aceptar". La opción 'Mostrar:Máscaras' proporcionará una imagen de paramecia extraída (Figura 1G), con una lista del número de partículas(paramecia)en cada fotograma.
11. Trace el número de paramecias que quedan en la cámara de grabación a lo largo del tiempo. Debido a que las estimaciones del número de paramecia son ruidosas, recomendamos realizar una media móvil en cada punto en un rango de 600 fotogramas (1 min) en la hoja de cálculo.

Representative Results

Figura 1. Ensayo de captura de presas y datos representativos en larvas de pez cebra abladas por láser. (A) Sistema de grabación conductual. El estereomicroscopio estaba equipado con una cámara CMOS. Las imágenes se adquirieron mediante un script hecho a medida. (B) Componentes del sistema de iluminación. Un papel de color gris, un difusor de vidrio, luz de anillo LED blanco, difusor, un espaciador hecho a medida (cartón) y difusor con un agujero en el centro. (C) El sistema de iluminación montado a partir de las piezas mostradas en B. (D) Cámara de grabación para el ensayo de captura de presas. Se colocó una cámara (diámetro: 20 mm; profundidad: 2,5 mm) en un tobogán de vidrio. El sello superior original de la cámara fue despegado. Una cubierta de vidrio fue puesta en la cámara de grabación. (E) Imagen raw de un fotograma de la película grabada. (F) Un fotograma dividido (píxel por píxel) por una imagen promedio en una película. Tenga en cuenta que el fondo no uniforme en la iluminación puede ser compensado por este procesamiento de imágenes. (G) Paramecia extraída de un marco utilizando la función "Análisis de partículas" en Fiji. (H) Ejemplo de imagen en Fiji con un umbral aplicado. La paramecia parece brillante, mientras que los ojos de la larva de pez cebra aparecen oscuros, y el fondo es gris. Los cambios en las posiciones oculares(es decir,ángulos con respecto al eje del cuerpo) se pueden calcular, si es necesario. (I) Datos experimentales representativos del consumo de paramecium en una larva de control olfativa-bulbo-ablated (OB) y una larva pretectum-ablated (PT). La ablación pretectum redujo significativamente la capacidad de caza de presas, mientras que la ablación de bulbos olfativos no la afectó.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5	Used as a behavioral recording chamber
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	Model:C11440-22CU	A scientific CMOS camera
SZX7	Olympus		Stereoscope
A ring LED light	CCS	Model: LDR2-100SW2-LA	White LED
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	Used as a recording chamber in Ca imaging