Novo ensaio de mergulho em tanque: um método para estudar as respostas inatas ao estresse em peixe-zebra

Resumo

Fonte: Chin J.S.R., et al. Abordagens comportamentais para estudar o estresse inato em peixes-zebra. J. Vis. Exp. (2019)

O artigo descreve um método comportamental para avaliar o estresse no peixe-zebra. Em resposta ao estresse, o peixe-zebra tende a nadar no fundo de um tanque até que o estresse seja removido. O protocolo de amostra descreve o método passo a passo para realizar o ensaio.

Protocolo

1. Nova configuração de teste de tanque

1. Prepare um copo de 250 mL pré-cheio com água do sistema de peixes e pelo menos dois tanques de retenção.
2. Na manhã do teste, transfira pelo menos 10 peixes-zebra adultos de teste para serem usados em cada condição experimental (controles e adultos experimentais) da instalação de peixes para um tanque de retenção, transfira-os para a sala de comportamento e deixe-os se aclimatar por pelo menos uma hora.
   nota: Uma análise de poder deve ser realizada antes da experimentação, mas em nossas mãos, um n = 10 geralmente é suficiente para detectar significância estatística. Além disso, o tanque de retenção não deve conter mais de cinco indivíduos por litro de água. Uma aclimatação de uma hora é suficiente, pois os adultos de peixe-zebra demonstraram se habituar a 30 minutos de um novo tanque. Além disso, os ritmos comportamentais são afetados por processos circadianos e, portanto, réplicas experimentais feitas em dias diferentes devem ser realizadas nas mesmas horas. Normalmente realizamos todos os experimentos entre as 11:00 e as 18:00
.
3. Rotule os tanques de forma que a condição ou genótipo dos animais seja cego para o experimentador.
   nota: Os experimentos podem ser facilmente cegos para o experimentador rotulando os tanques usando um sistema de letras ou números (ou seja, um tanque é rotulado como 'A', outro como 'B', etc.). Uma parte não envolvida nos experimentos rotula os tanques com esse sistema e mascara as identidades do experimentador até que a pós-análise seja concluída.
4. Com uma rede, coloque delicadamente um único adulto no copo pré-cheio do passo 1.1. Deixe os peixes adultos se aclimatarem no béquer por 10 minutos.
   nota: Registre o sexo do adulto, pois pode ser importante após a análise procurar diferenças específicas do sexo.
5. Após a aclimatação no copo, introduza o peixe no novo tanque (detalhes da configuração abaixo) despejando suavemente a água e o adulto do copo.
   nota: As etapas nesta seção descrevem a configuração do novo ensaio de tanque. Um diagrama do produto final é dado na Figura 1B.
   1. Coloque o novo tanque no meio da mesa.
   2. Posicione as luzes infravermelhas atrás do tanque e coloque a folha de acrílico branco ou a tela difusora entre o tanque e a fonte de luz LED.
   3. Coloque o difusor de forma que ele espalhe ao máximo a luz proveniente dos LEDs, e a intensidade da luz seja suficiente para iluminar o novo tanque. Quanto mais próxima a placa estiver da fonte de luz, mais brilhantes serão as luzes, mas menos ela se difundirá. Por outro lado, colocar a placa difusora longe da fonte de luz reduzirá a intensidade da luz, mas espalhará melhor a luz.
   4. Encha aproximadamente três quartos do novo tanque com água do sistema de peixes.
      nota: A água do sistema é gerada usando osmose reversa de água da torneira, seguida de dosagem de forma que a condutividade seja igual a 900 ± 100 μS, que o pH seja neutro (7,2) e que a temperatura seja de 27 ± 1 °C.
   5. Conecte a câmera ao suporte da câmera e conecte a câmera ao computador. Abra o software de aquisição de vídeo e ajuste a câmera para ficar de frente para o tanque e certifique-se de que todo o novo tanque possa ser visto e que não haja áreas obscurecidas no vídeo. Ajuste o tanque e as luzes infravermelhas de forma que haja iluminação suficiente e uniforme em todo o tanque quando observado pela câmera.
      nota: Antes de prosseguir com os experimentos, muitas vezes pode ser útil realizar um teste, no qual o vídeo de um peixe é capturado e o rastreamento é realizado. Isso garantirá que a configuração seja suficiente para a experimentação do comportamento.
6. Depois de introduzir o adulto no novo tanque, inicie a gravação da câmera e afaste-se da configuração para evitar sofrimento adicional aos peixes.
7. Após o término da gravação, remova o indivíduo do novo tanque e coloque-o em um novo tanque de retenção.
   nota: Deve ser utilizado um tanque de retenção diferente do indicado no passo 1.2 para evitar a repetição de ensaios nos mesmos indivíduos.

Resultados

Figura 1. Diagrama da nova configuração do tanque.(A) Dimensões do novo tanque trapezoidal de 1,8 L visto do lado de registro do tanque. (B) Diagrama da configuração, incluindo as posições das luzes infravermelhas, câmera e barreiras usadas para minimizar a interferência humana.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
câmera			Usamos a câmera USB Point Grey Grasshopper3 com lente da Edmund Optics.
Filtro infravermelho	Óptica Edmund
Programa de aquisição de vídeo			Use programas como Virtualdub ou FlyCapture porque a taxa de quadros de aquisição pode ser definida.
Luzes LED infravermelhas
Tanque de ensaio	Aquaneering	Número da peça ZT180	Tamanho: M3 1,8 litro
Suporte e braçadeira, ou tripé padrão para câmera
Copo de 250mL
Software de rastreamento			Usamos o Ethovision XT 13 da Noldus Information Technology