A função do gene pode ser obscurecida na perda de função experimentos se houver compensação por outro gene. O modelo de zebrafish fornece um relativamente alto rendimento significa revelar redundância funcional como em embriões vivos.
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Artigo de método
A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese
Neste artigo
Resumo
Resumo
A função do gene durante a embriogênese é normalmente definida por perda de função experimentos, por exemplo, mutagênese alvo (knockout) no mouse. No modelo peixe-zebra, eficazes técnicas de genética reversa têm sido desenvolvidos usando microinjeção de morpholinos gene antisense específicos. Morpholinos alvo um mRNA através da base de emparelhamento específica e função do gene bloco transitoriamente pela tradução inibir ou splicing por vários dias durante a embriogênese (knockdown). No entanto, em vertebrados, como mouse ou peixe-zebra, algumas funções do gene pode ser obscurecida por estas abordagens, devido à presença de outro gene que compensa a perda. Isto é especialmente verdade para as famílias de genes que contém genes irmã que são co-expressos nos mesmos tecidos em desenvolvimento. Em peixes-zebra, a remuneração funcional pode ser testada de uma forma relativamente alto rendimento, por co-injeção de morpholinos que knockdown alvo de ambos os genes simultaneamente. Da mesma forma, usando morpholinos, uma interação genética entre dois genes pode ser demonstrado pelo knockdown de ambos os genes juntos no sub-threshold níveis. Por exemplo, morpholinos pode ser ajustada de tal forma que nem knockdown indivíduo gera um fenótipo. Se, nessas condições, co-injeção de ambos morpholinos causa um fenótipo, uma interação genético é mostrada. Aqui demonstramos como mostrar redundância funcional no contexto de dois fatores de transcrição GATA relacionados. Fatores GATA são essenciais para a especificação de células progenitoras cardíacas, mas isso só é revelada pela perda de ambos os Gata5 e Gata6. Mostramos como a realização de experimentos microinjeção, validar o morpholinos, e avaliar o fenótipo compensado do coração.
Protocolo
Nosso objetivo aqui é testar a redundância funcional de dois fatores de transcrição para a especificação de progenitores de cardiomiócitos. Os fatores são codificados por dois genes relacionados gata5 e gata6 e estamos usando o modelo de zebrafish para entender suas funções relativas 1. Nossa estratégia é bloquear a função do gene usando morpholinos 2. Vamos injetar morpholinos para um ou o outro gene em ovos fertilizados, e comparar o fenótipo embrionárias com embriões derivados de ovos injetados simultaneamente com ambos os morpholinos. Para simplificar a avaliação de fenótipos, usamos ovos derivados de peixes que carregam um....
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Discussão
No experimento descrito aqui, combinamos duas morpholinos, cada qual por si só gerar uma gama de fenótipos distintos, e encontrou um fenótipo totalmente diferente quando foram co-injetados juntos. É claro, precisávamos de uma justificação para fazer esta experiência, em primeiro lugar. Nós suspeitamos que os dois genes pode compensar o outro para uma função mais cedo, nesta especificação caso cardíaca. Isso ocorre porque os genes são altamente relacionados (e capazes de se ligar às seqüências de DNA mesmo) e são express.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos a membros do laboratório de Evans pela sua ajuda na preparação desta apresentação. O morpholinos usados aqui foram originalmente validados pelo Dr. Audrey Holtzinger. TE é suportado por concessões do National Institutes of Health (HL064282 e HL056182). Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Instituto de Animal Care e do Comitê de Uso, do Weill Cornell Medical College.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tanques e divisórias para criação de peixes | Aquatic Habitats | ||
| Redes para peixes | Aquatic Habitats | ||
| Água do sistema | 60 mg de Instant Ocean” por litro de dH2O | ||
| Placas de Petri de 100 mm | BD Biosciences | 351029 | |
| Puxador de agulhas para micropipeta | Sutter Instrument Co. | P-97 Flaming/Brown | |
| Capilares de vidro de 3,5" | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Lâmina de barbear | Personna Medical Care | 94-120-71 | |
| Micromoinho | Narishige International | EG-4 | |
| Ocular de microscópio com grade | Premiere | MF-02 | |
| Micrômetro | WARD’s Natural Science | 94 W 9910 | |
| Agarose ultrapura | Invitrogen | 15510-027 | |
| Esptula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Balança | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | |
| Placas descartáveis para pesagem | Fisher Scientific | 2-202-B | |
| Micro-ondas convencional | GE Healthcare | ||
| Frasco Erlenmeyer | Corning | 4980 | |
| Lâminas de microscópio | Fisher Scientific | 12-552 | |
| Proveta graduada | Fisher Scientific | 08-572-6D | |
| Pipetador automático | BrandTech | 2026333 | |
| Solução de lavagem com etanol 70% | Tarr | 801VWR | |
| Botijão de N2 | Tech Air | ||
| Microinjetor | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micromanipulador | Micro Instruments | LTD | |
| Microscópio estereoscópico | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Parafilm | American National Can | PM-992 | |
| Óleo mineral | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| gata5 morfolino do sítio de splice | Genetools, LLC | 5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’ | |
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’ | |
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’ | |
| Pipeta Pasteur descartável | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Tricaina metanosulfonato | Argent Labs | MS-222 | |
| Metilcelulose | ICN Biomedicals | 155495 | |
| Bloco de aquecimento | Fisher Scientific | 11-718-4 | |
| Pinceta fina | Dumont | Tamanho 55 | |
| Lâminas de fundo cavado | VWR international | 48339-009 |
Referências
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6,....
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Reimpressões e permissões
