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1. Geração de Mamosferas Primárias a partir de Linhagens Celulares de Câncer de Mama Humano
NOTA: Execute as etapas a seguir sob uma capa de cultura estéril.
- Prepare o Mammosphere Media contendo DMEM / F12 suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina. Prepare o meio completo imediatamente antes do uso, adicionando 20 ng/ml de fator de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF; Sigma), fator de crescimento básico de fibroblastos humanos recombinantes de 10 ng/ml (bFGF; Sistemas de P&D) e 1x suplemento B27.
- Aspire o meio do frasco contendo células MCF-7 ou MDA-MB-231 aderentes (ou uma linha celular de câncer de mama de sua escolha; 70-80% de confluência), lave duas vezes em 1x PBS e tripsinize as células.
- Centrifugue as células a 200 x g à temperatura ambiente por 5 min. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células em 1-5 ml de meio de mamosfera. Pipetar para cima e para baixo e, se necessário, utilizar um filtro de 40 μm para obter uma suspensão unicelular. Use um hemocitômetro para garantir que uma única suspensão celular tenha se formado (caso contrário, use uma agulha de 25 G para seringar a suspensão celular até 3 vezes).
- Se necessário, isole o subconjunto celular CD44+CD24- via FACS usando anticorpos monoclonais anti-CD24-ficoeritrina (PE) e anti-CD44-fluoresceína isotiocianato (FITC)9. Alternativamente, isole essa população usando um sistema de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) com microesferas combinadas anti-CD44 e anti-CD24-biotina de acordo com as instruções do fabricante. Realize a seleção positiva usando colunas LS e a seleção negativa usando colunas LD e confirme os fenótipos de todas as células isoladas por citometria de fluxo.
- Calcular o número de células viáveis por ml utilizando o azul de tripano.
nota: A viabilidade celular é calculada como o número de células viáveis dividido pelo número total de células dentro das grades do hemocitômetro. As células que absorvem azul de tripano são consideradas inviáveis. O procedimento a seguir é usado para determinar com precisão a proporção de células viáveis.
- Prepare uma solução de azul de tripano a 0,4% em PBS. Adicione 0,1 ml de solução-mãe de azul de tripano a 1 ml de células. Carregue um hemocitômetro e examine imediatamente ao microscópio em baixa ampliação. Conte o número de células totais e o número de células de coloração azul. Células viáveis = [1,00 – (Número de células azuis ÷ Número de células totais)] × 100.
- Para calcular o número de células viáveis por ml de cultura, use a fórmula abaixo. Lembre-se de corrigir o fator de diluição.
Número de células viáveis × 104 × 1,1 = células/ml de cultura
- Ressuspenda uma quantidade pré-determinada de células em 2 ml de meio completo de mamosfera em cada poço de uma placa aderente ultrabaixa de 6 poços. A densidade de semeadura é normalmente de 500-4.000 células/cm2 células por poço. Opcionalmente, use placas de 24 poços de baixa fixação enquanto semeia células na mesma densidade em 0,5 ml de meio.
nota: Recomenda-se a otimização da densidade de semeadura e do tempo de cultivo para cada linhagem celular de interesse.
- Incubar placas de 6 poços de fixação ultrabaixa a 37 °C e 5% de CO2 por 5-10 dias (dependendo da linhagem celular e do tamanho das mamosferas) sem perturbar as placas, particularmente durante a fase de crescimento dos primeiros 5 dias.