Transdução para Marcar Células Tumorais PDX: Introdução do Marcador Fluorescente que Expressa Lentivírus na Célula Tumoral In Vitro

Neste artigo

Resumo

Fonte: Hanna, C., et al. Rotulagem de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Câncer de Mama com Repórteres Rastreáveis para Estudos de Crescimento e Metástase Tumoral. J. Vis. Exp. (2016).

O vídeo a seguir descreve uma técnica de transdução para rotular células tumorais PDX (xenoenxertos derivados de pacientes), que é usada para introduzir repórteres de proteína fluorescente verde e luciferase que expressam lentivírus na célula tumoral in vitro.

Protocolo

1. Transdução de células tumorais derivadas de PDX

Centrifugar células tumorais dissociadas a 300 g x 5 min e ressuspender em meio de mamosfera de 2 ml. Conte as células viáveis usando a exclusão de azul de tripano (ressuspenda as células digeridas em tampão de lavagem de 5 ml e conte as células viáveis e não viáveis usando a exclusão de azul de tripano. Resumidamente, misture 50 μl de células e 50 μl de azul de tripano e conte as células excluídas com um hemocitômetro).
Preparar 10 ml de meio de mamosfera contendo 8 μg/ml de polibreno (2 μl de unidade de estoque de polibreno por ml de meio).
Determine o volume necessário para 2 x 10⁵ células tumorais viáveis. Centrifugue as células a 300 x g por 5 min e ressuspenda o pellet em 2 ml de meio contendo polibreno. Placa 2 x 10⁵ células tumorais viáveis por poço em uma placa de cultura de tecidos de ultrabaixa aderência de 6 poços.
nota: Este é um número ideal de células necessárias para a transdução com um vetor lentiviral.
cuidado!As partículas lentivirais e todos os consumíveis usados com partículas lentivirais devem ser manuseados seguindo os procedimentos institucionais para riscos biológicos do DNA recombinante.
nota: A transdução lentiviral de células primárias da mama favorece fortemente as células mioepiteliais, o que pode resultar em má marcação de células luminais e seleção de subpopulações de células tumorais durante a marcação.
Incubar o vírus com 200 mU/ml de neuraminidase a 37 °C durante 1 hora antes da transdução para aumentar a ligação das partículas virais a diferentes subpopulações de células primárias e corrigir este potencial enviesamento.
Adicione partículas lentivirais a 10 MOI (2 x 10⁶ TU para 2 x 10⁵ células viáveis) se as células dissociadas por PDX forem esgotadas de células de camundongo Lin + ou enriquecidas em células EpCam +. Adicionar partículas lentivirais a 30 MOI (6 x 10⁶ TU para 2 x 10⁵ células viáveis) se estiver usando células dissociadas de PDX não enriquecidas.
nota: O aumento do MOI permite uma transdução eficiente mesmo na presença de grandes quantidades de detritos e células mortas em extratos brutos. Mantenha um poço com células não marcadas para servir como um controle de viabilidade e eficiência de transdução.
Gire para misturar vírus com células. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ por até 96 horas. Adicione 500 μl de meio fresco da mamosfera 24 horas após a transfecção. As células não se ligam às placas, não aspiram os meios.

2. Avaliação da Eficiência de Transdução e Reimplantação de Células Marcadas em Camundongos Imunocomprometidos

Monitore a expressão do marcador rastreável (GFP) a cada 24 horas usando um microscópio fluorescente com ampliação de 10X.
nota: A expressão de GFP pode ser observada 24 horas após a infecção, mas na maioria dos PDXs a expressão de GFP é claramente visível após 72 horas (Figura 1).
Estimar a eficiência da transdução avaliando a porcentagem de células GFP+ dentro do poço total.
nota: Como as culturas contêm células tumorais, células estromais residuais e células mortas em vários graus, poços com apenas 10% de células GFP+ podem ser implantados em um camundongo hospedeiro.
Transfira as células transduzidas de placas de 6 poços para um tubo cônico de 15 ml. Adicione 1 ml de meio de mamosfera ao poço para coletar todas as células deixadas para trás. Coloque no gelo.
Adicione 10 ml de HBSS/hepes às células transduzidas e centrifugue a 300 x g por 5 min, 4 °C. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda em 50 μl de extrato de matriz basal (BME) em gelo.
nota: As alíquotas BME devem ser descongeladas no gelo, 1 a 2 horas antes do uso. O BME solidificará à temperatura ambiente; Mantenha no gelo o tempo todo.
Carregue as células embebidas em BME em uma seringa de insulina de 0,5 ml, mantenha no gelo e leve para a instalação animal para reimplantação em camundongos NSG.

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Resultados

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Figura 1: Rastreamento da eficiência de transdução em células PDX dissociadas. A) Células dissociadas em PDX enriquecidas para células epiteliais humanas (depleção de Lin +) 24 horas após a transdução com partículas lentivirais pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro. B) Células dissociadas em PDX de um experimento separado, sem enriquecimento de células epiteliais, 72 horas após a transdução com pHAGE...