Co-cultura de células BC: Cultura de células de câncer de mama com fragmentos ósseos para estudar a proliferação de células cancerígenas

Resumo

Fonte: Templeton, Z. S., et al. Métodos para Cultura de Explantes de Tecido de Fêmur Humano para Estudar a Colonização de Células de Câncer de Mama do Nicho Metastático. J. Vis. Exp (2015).

Este vídeo descreve a cultura de células de câncer de mama adjacentes a explantes ósseos de fêmur para medir a proliferação e colonização de células cancerígenas em um sistema modelo de explante de tecido ósseo humano.

Protocolo

1. Co-cultura de células de câncer de mama adjacentes a fragmentos ósseos para medir a proliferação de células mamárias usando BLI

1. Antes do experimento, prepare uma suspensão contendo 2 x 10⁵ células de câncer de mama / 50 μl e prepare tampões de cera óssea para imobilizar fragmentos ósseos em cultura. Corte uma ponta de micropipeta P200 em 3 pedaços e use a extremidade estreita do pedaço maior de maneira "cortador de biscoitos" para cortar pequenos (~ 35 mg) pedaços de cera óssea. Use a extremidade larga da peça menor para ejetar os plugues de cera óssea em uma placa de Petri para armazenamento.
2. Coloque um pedaço de cera de osso na posição de 12 horas de cada poço e pressione suavemente com um dedo indicador enluvado estéril.
3. Pipete 50 μl de suspensão celular contendo 1 x 10⁵ células de câncer de mama em DMEM-10% FBS + Pen-Strep no centro de cada poço de uma placa de 6 poços. (Alternativamente, semeie células em um padrão disperso, se desejado.) Coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C por 45 min para promover a fixação das células.
4. Coloque 1 fragmento de osso em 1 pedaço de cera óssea para cada poço experimental e aplique uma leve pressão com o rongeur para prendê-lo. Realize experimentos em triplicata, de modo que 3 fragmentos ósseos de uma determinada amostra de THR sejam colocados nos três poços superiores, enquanto os três poços inferiores contêm cera óssea apenas como controles.
5. Usando uma pipeta de 5 ml, administre suave e lentamente 5 ml de DMEM-10% FBS na lateral de cada poço para evitar o deslocamento das células da mama ou fragmentos ósseos. Colocar a placa numa incubadora de cultura de tecidos a 37 °C durante 20-24 horas.
6. Para realizar imagens de bioluminescência (BLI), remova a placa da incubadora e adicione substrato de luciferina (para atingir uma concentração de 300 μg / ml) a cada poço. Visualize a placa imediatamente em uma plataforma de imagem IVIS usando os seguintes parâmetros: f-stop de 1, binning pequeno, tempo de exposição de 1 seg, nível D. Meça a intensidade do sinal de cada poço como radiância média (fótons/segundo/centímetro quadrado/esterradiano).
7. Use o software de imagem para definir Regiões de Interesse (ROI) para quantificar a radiância média de todos os poços experimentais e de controle. Exporte valores médios de radiância para uma planilha do Excel para realizar estatísticas e gerar gráficos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Tecnologias da Vida	Rolamento 10569-010	Suplementar todo o DMEM com 10% de soro fetal bovino e 1% de Pen/Strep
Soro fetal bovino	Tecnologias da Vida	16000-044
Penicila estreptomicina	Tecnologias da Vida	15140-122
D-luciferina vaga-lume, sal de potássio 5 g (30 mg/ml)	Tecnologias da Vida	L-8220
Conjunto de cultura de células tratadas com TC de 6 poços	Corning Incorporada	3516
Friedman-Pearson Rongeur	Ferramentas de Belas Ciências	16021-14
Cera óssea	Corporação de Especialidades Cirúrgicas	Pedido 903
Plataforma de imagem IVIS 50	Caliper Ciências da Vida/PerkinElmer
Células de câncer de mama MCF-7	ATCC	HTB-22
Células de câncer de mama MDA-MB-231	ATCC	HTB-26