Injeção intraductal: Aplicação da mistura de injeção nos ductos da glândula mamária do camundongo

Resumo

Fonte: Xiang, D., et al. Modelando o câncer de mama por meio de uma injeção intraductal de adenovírus que expressa Cre na glândula mamária de camundongo. J. Vis. Exp (2019).

Este vídeo descreve uma técnica de injeção intraductal em que administramos uma mistura de injeção nos dutos das glândulas mamárias de camundongos.

Protocolo

1. Injecção intraductal

1. Use técnicas assépticas durante todo o procedimento cirúrgico.
2. Faça um local de incisão na pele com um comprimento de ~ 1 cm entre os dois quartos MGs inguinais (Figura 1). Separe cuidadosamente o retalho cutâneo (com o MG) do peritônio parietal para visualizar a árvore ductal mamária.
3. Segure cuidadosamente o mamilo com uma pinça de relojoeiro e remova o mamilo externo sem cortar a pele próxima, usando uma tesoura de microdissecação.
4. Carregue ~ 3–5 μL da mistura de injeção de Ad-Cre em uma seringa Hamilton de 25 μL com uma agulha de cubo de metal de 33 G afixada. Estime o volume da mistura injetável na seringa com base no corante azul incluído na mistura.
   nota: Use um volume menor (por exemplo,., 3 μL) ao injetar em MGs de fêmeas de 3 a 4 semanas de idade e um volume maior (por exemplo,., 10 μL) ao injetar em MGs de fêmeas lactantes.
5. Segure suavemente a borda do retalho cutâneo com uma pinça curva fina e injete a mistura de injeção de Ad-Cre lentamente no mamilo, enquanto monitora a disseminação do corante azul na árvore ductal mamária. Mantenha a taxa de injeção o mais baixa possível para evitar danos ao lúmen ductal.
   nota: O fluido injetado (conforme ilustrado pelo corante azul de bromofenol incluído) espalhando-se por toda a árvore ductal sem vazar para o compartimento estromal indica uma injeção intraductal bem-sucedida.
6. Retire suavemente a agulha do mamilo para evitar qualquer vazamento do fluido injetado.
7. Examine o lado distal (ou seja, longe do mamilo) do MG ou a área circundante do mamilo injetado. Observe que o inchaço do corante azul (ou seja, o corante que se difunde no estroma próximo) indica uma injeção de almofada de gordura mamária em vez de uma injeção intraductal bem-sucedida.
8. Feche as feridas cirúrgicas (de 1.2) na pele com clipes de ferida.

2. Cuidados pós-operatórios

1. Remova o mouse da anestesia e coloque-o em uma almofada de aquecimento dentro de uma gaiola limpa para recuperação.
2. Administrar meloxicam por via subcutânea a 5 mg/kg novamente, 24 h após a cirurgia.
3. Monitore as condições gerais do animal e procure sinais de infecção no local da incisão por 5 dias.
4. Os clipes da ferida são removidos ~ 7-10 dias após a cirurgia.

Resultados

Figura 1: Diagrama esquemático da injeção intraductal do vírus Ad-Cre em um MG.(A) Local da incisão na linha média entre os dois quartos MGs. (B) Injeção intraductal de Ad-Cre com um corante azul (para melhor visualização) em um dos quartos MGs. (C) Fechamento da incisão na pele por clipes de ferida

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulha de calibre 33	Hamilton	7803-05	Ponto Estilo 3 Blunt
Clipe reflexo de 7 mm	Braintree Científico	RF7 CS
Adenovírus Ad-K5-Cre	Núcleo de vetor viral da Universidade de Iowa	Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)
Adenovírus Ad-K8-Cre	Núcleo de vetor viral da Universidade de Iowa	Ad5mK8-nlsCre
Azul de Bromofenol	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Seringa Hamilton	Hamilton	7636-01	0,025 mL
Tesoura de microdissecação	Pentair	9 milhões	Fórceps do Relojoeiro
Pinças de microdissecação	Dumont	M5