Meio Condicionado por Órgãos: Meio Gerador de Células de Órgãos Colhidas para Estudos de Câncer Metastático

Resumo

Fonte: Piaseczny, M. M., et al. Geração de Mídia e Aplicações Condicionadas por Órgãos para Estudar Influências Específicas de Órgãos no Comportamento Metastático do Câncer de Mama. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo descreve um método de geração de um meio condicionado por órgãos derivado do fígado de camundongo. Este sistema modelo pode ser usado para identificar e estudar fatores solúveis derivados de órgãos e seus efeitos no tropismo de órgãos e no comportamento metastático das células cancerígenas.

Protocolo

1. Geração de Meios Condicionados ao Pulmão e ao Cérebro

1. Em uma capa de cultura de tecidos estéril, inverta os tubos PBS contendo pulmão ou cérebro três vezes para remover o sangue residual dos órgãos e aspire o PBS contendo sangue. Repita com PBS fresco e frio até que a solução pareça límpida, sem evidência de sangue.
2. Coloque os pulmões e os cérebros em placas de Petri de vidro separadas de 60 mm2. Usando duas lâminas de bisturi estéreis, pique os pulmões ou cérebros cortando repetidamente para frente e para trás até que os fragmentos de tecido tenham aproximadamente ~ 1 mm3 de tamanho.
3. Determine a quantidade de meio necessária para ressuspender fragmentos de tecido a partir da diferença de peso calculada.
   nota: O tecido pulmonar e cerebral é normalizado em peso por ressuspensão em uma proporção de 4:1 mídia:tecido (vol/peso).
4. Ressuspenda fragmentos de tecido em volume apropriado (determinado anteriormente na etapa 1.3) do meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM): meio F12 suplementado com suplemento de mitógeno concentrado 1x e penicilina (50 μg / ml) / estreptomicina (50 μg / ml).
5. Adicione fragmentos de tecido pulmonar ou cerebral ressuspensos a um poço de uma placa de 6 poços.
6. Incubar fragmentos de tecido em meio por 24 horas a 37 ° C e 5% de CO2. Após a incubação, recolher o meio condicionado para cada tecido e diluir adicionando três volumes equivalentes de meio fresco num tubo cónico de 50 ml.
7. Centrifugue a 1.000 x g em meio condicionado diluído para cada órgão a 4 °C por 15 min para remover grandes detritos teciduais. Colete o sobrenadante do meio e filtre através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
8. Agrupe meios condicionados de cada órgão (ou seja, pulmão com pulmão e cérebro com cérebro) de vários camundongos para levar em conta a variabilidade de camundongo para camundongo. Alíquota e armazenar os suportes condicionados a -80 °C até à utilização.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1x solução salina tamponada com fosfato	ThermoFisher Scientific	10010-023	Manter estéril
Placas de Petri de vidro de 60 mm2	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Manter estéril
DMEM: F12	Tecnologias da Vida	Rolamento 21331-020	Aquecer em banho-maria a 37 °C antes de usar, manter estéril
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)	Tecnologias da Vida	15140-122	Manter estéril
Tubos cônicos de 50 ml	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Manter estéril
Filtros de seringa de 0,22 μm	Sigma-Aldrich	Z359904	Manter estéril
Placas de cultura de tecidos de 6 poços	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Manter estéril
Lâminas de bisturi	Fisher Científico	S95937A	Manter estéril