Inflação de tinta nanquim: um método de coloração para visualizar nódulos tumorais

Resumo

Fonte: Paschall, A. V. et al. Um modelo ortotópico de camundongo de metástase espontânea de câncer de mama. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo descreve a inflação da tinta nanquim - um método de coloração - para quantificar nódulos tumorais em pulmões de camundongos portadores de tumor. Após a coloração, os pulmões são fixados na solução de Fekete para observar nódulos tumorais nos pulmões.

Protocolo

1. Validação de metástases pulmonares usando insuflação de tinta nanquim de pulmões portadores de tumor

NOTA: Para validar os resultados de imagem de tumor vivo com luciferase, execute a insuflação com tinta nanquim dos pulmões de camundongos portadores de tumor para quantificar os nódulos tumorais. As células 4T1 também metastatizam para outros órgãos e tecidos (Figura 1) e, portanto, o exame histológico desses órgãos para validar a metástase tumoral deve ser realizado, se necessário. Este protocolo usa metástase pulmonar como exemplo.

1. Mantenha os ratos em sua gaiola doméstica existente para a eutanásia. Quando alojados com outros animais, realoque os ratos que não estão sendo sacrificados para uma gaiola diferente.
2. Remova a parte superior do filtro da gaiola e substitua pela parte superior do filtro de CO2. Ligue o cilindro de gás CO2 comprimido (100%) que está conectado à parte superior do filtro de CO2. Defina a vazão em 2 L/min e mantenha o CO2 ligado por pelo menos 10 min. Se os ratos ainda estiverem respirando ao final de 10 minutos, deixe o CO2 ligado até pelo menos 1 minuto depois que os ratos pararem de respirar. Desligue o controle do cilindro de CO2 e o medidor de vazão. Aguarde mais 3 minutos e remova a tampa do filtro.
3. Coloque o rato sacrificado de costas em uma placa de poliestireno. Prenda as pernas para garantir o acesso desobstruído à traqueia. Pulverize os ratos com etanol 70%.
4. Usando uma tesoura, corte ao longo da linha média do abdômen médio do camundongo através da caixa torácica e em direção às glândulas salivares. Observe a traqueia. Use uma pinça para remover os tecidos ao redor da traqueia para expor a traqueia.
5. Passe uma ponta de pipeta por baixo da traqueia. Segurando a ponta com uma mão, levante suavemente a traqueia para cima e para longe do corpo.
6. Gire a plataforma segurando o mouse 180°. Use uma seringa de tuberculina 1/2 CC 27 G 1/2 para injetar tinta nanquim (10% de tinta nanquim e 0,1% de hidróxido de amônio) nos pulmões através da traqueia. Encha completamente os pulmões com tinta até sentir uma forte resistência.
7. Use uma tesoura para cortar a traqueia. Use uma pinça para segurar o mouse e insira outro conjunto de pinças sob os pulmões e puxe os lobos pulmonares para fora do mouse. Lavar brevemente os pulmões num copo com água.
8. Em uma capela de exaustão química, transfira os pulmões para um frasco de cintilação de vidro contendo 3 ml de solução de Fekete (50% de etanol, 6% de formaldeído e 3% de ácido acético glacial). Tampe o frasco para evitar que a solução evapore.
   nota: Os tecidos podem ser armazenados na solução de Fekete indefinidamente.
9. Após alguns minutos, observe os nódulos tumorais como pontos brancos nos pulmões pretos (Figura 1). O nódulo branco do tumor é visível pelos olhos. Transfira os pulmões para um prato em uma hotte e conte o número de manchas brancas. Cada mancha branca representa um único nódulo tumoral metastático.

Resultados

Figura 1. Visualização de nódulos tumorais de pulmão por insuflação de tinta nanquim. O pulmão do camundongo portador do tumor foi inflado com tinta nanquim e fixado na solução de Fekete. Os pontos brancos são metástases pulmonares.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aplicador de AutoClip de 9 mm	Becton Dickinson Diagnóstico de Cuidados Primários. Faíscas, MD	Nº 427630
Tesoura de dissecação pontiaguda	pescador	8940
Dissecando pinças de ponta fina	pescador	Nº 8875
70% de etanol	Ultrapure-usa.com
Seringa de tuberculina 1/2 CC 27 G 1/2	Becton Dickinson e Co. NJ	Rolamento 305620