Dissociação mecânica: um método para obter células viáveis de um tecido

Resumo

Fonte: Garaud et. al., Um protocolo simples e rápido para dissociar tecidos humanos frescos não enzimaticamente para a análise de linfócitos infiltrantes. J. Vis. Exp. (2014).

Este vídeo descreve a dissociação não enzimática de tecido humano fresco para obter células viáveis. A técnica é utilizada para análise qualitativa e quantitativa de células CD45 positivas (linfócitos/leucócitos) presentes em vários tecidos humanos normais e malignos.

Protocolo

1. Preparação do Homogeneizado de Tecidos

1. Os tecidos ressecados dissecados (tecido maligno e normal ressecado da sala de cirurgia) estão no laboratório de patologia por pessoal treinado para coleta imediata. Fragmentos de tumor, NANT (tomados o mais longe possível do tumor) e fragmentos de tecido normal são rotineiramente processados dentro de 1 a 3 horas após a excisão cirúrgica em um laboratório BSL2 usando procedimentos padrão de biossegurança para tecidos humanos. Um fluxograma do protocolo é ilustrado na Figura 1.
2. Pesar todos os fragmentos de tecido (normal, NANT e tumor) e medir o comprimento, largura e altura (comprimento ....

Resultados

Figura 1: Fluxograma do protocolo.Nosso procedimento para processamento de tecidos humanos frescos e algumas abordagens analíticas que podem ser usadas posteriormente para avaliar linfócitos que se infiltram em tecidos humanos são mostrados.

Figura 2: Imagem corada com H & E de uma impressão de tec.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dissociador GentleMacs	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine é um pouco equivalente
Centrífuga 5810 R	Eppendorf		ou o outro centrifugador padrão do tampo de mesa
Centrífuga 5417 R	Eppendorf		ou outra microcentrífuga padrão
Gabinete de Biossegurança Esco Classe II A2	ESCO global		ou outro capô BSL2 padrão
Microscópio invertido	Nikon eclipse TS100		ou outro microscópio compatível para um hemacitômetro
Bürker Chamber Marienfield		Nº 640210	ou outro hemacitômetro padrão
Navios Citômetro de Fluxo	Beckman Coulter		ou outro citômetro de fluxo (8-10 cores recomendadas)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine usa Filcon
Placa de cultura celular	Sarstedt	72.710	ou outros artigos de plástico não pirogénicos
Bisturi descartável	Swann-Morton	510	ou bisturi estéril de uso único padrão
Filtro de células BD 40 μm	Becton Dickinson	Rolamento 734-0002	ou outros artigos de plástico não pirogénicos
Tubo BD Falcon 50 ml	Becton Dickinson	Rolamento 352070	ou outros artigos de plástico não pirogénicos
Tubo BD Falcon 15 ml	Becton Dickinson	352097	ou outros artigos de plástico não pirogénicos
Tubo BD FACS 5 ml	Becton Dickinson	352008	ou outros artigos de plástico não pirogénicos
Pipeta Pasteur Estéril 5 ml	VWR	Rolamento 612-1685	ou outros artigos de plástico não pirogénicos
Tubo de microfuga 1,5 ml	Eppendorf	Nº 7805-00	ou outros artigos de plástico não pirogénicos
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	meio sem soro recomendado
Solução salina tamponada com fosfato	Lonza	BE17-516F	PBS fisiológico padrão
Azul de tripano	VWR	17942E	ou outra mancha vital