1. Preparação do Homogeneizado de Tecidos
- Os tecidos ressecados dissecados (tecido maligno e normal ressecado da sala de cirurgia) estão no laboratório de patologia por pessoal treinado para coleta imediata. Fragmentos de tumor, NANT (tomados o mais longe possível do tumor) e fragmentos de tecido normal são rotineiramente processados dentro de 1 a 3 horas após a excisão cirúrgica em um laboratório BSL2 usando procedimentos padrão de biossegurança para tecidos humanos. Um fluxograma do protocolo é ilustrado na Figura 1.
- Pesar todos os fragmentos de tecido (normal, NANT e tumor) e medir o comprimento, largura e altura (comprimento x largura x altura). Este é um passo importante para a posterior normalização de subpopulações celulares, RNA extraído, etc.
nota: A faixa de tamanho da amostra é de 100 a 10.000 mm3 sem gordura, se possível.
- Imprima o fragmento do tumor em uma lâmina de vidro para coloração H & E para verificar se o tecido é realmente parte do tumor.
- Faça isso pressionando uma lâmina de microscópio de vidro no fragmento do tumor e aplicando uma leve pressão com os dedos por alguns segundos.
- Fixe a lâmina com isopropanol por 2 min, seguido de uma etapa de lavagem em água. Contra-core o tecido por 30 segundos com hematoxilina de Mayer.
- Lave o escorregador em seis banhos de água. Manchar em floxina B 2% por 15 segundos.
- Lavar em um banho de água seguido de quatro banhos de isopropanol e terminar com um banho de água.
- Incubar em isopropanol por 1 min e drenar. Claro em dois banhos de xileno.
- Monte com meio de montagem à base de xileno. Examine a celularidade tumoral (Figura 2).
nota: Principalmente, as células tumorais aderem à lâmina impressa - as células estromais, linfóides ou adiposas raramente permanecem, deixando espaços entre as células tumorais (Figura 2).
- Colocar o fragmento de tecido numa pequena placa de cultura contendo 1 ml do meio de células hematopoiéticas quimicamente definido e isento de soro (a seguir designado por meio) à temperatura ambiente e cortá-lo em pedaços pequenos (~1 - 2 mm2) utilizando um bisturi estéril.
- Transfira tudo (fragmentos de tecido + meio) para um tubo C dissociador mecânico.
- Lave a placa de Petri e o bisturi com 2 ml de meio usando uma pipeta Pasteur e adicione-o ao tubo C (volume do meio para dissociação = 3 ml).
- Use o programa dissociador mecânico A.01 para tubos C (o programa mais suave) para homogeneizar os fragmentos de tecido em uma única suspensão celular. Colocar o tubo C no aparelho e executar o programa duas vezes seguidas (um ciclo = 25 seg).
nota: Este procedimento de homogeneização foi estabelecido e validado para tecido mamário humano, outros tipos de tumor ou tecido podem precisar usar um programa diferente e devem ser testados primeiro.
- Retirar o tubo C do aparelho e decantar o homogeneizado directamente para um coador de células de 40 μm assentado num tubo de 50 ml. Usando a mesma pipeta Pasteur da etapa 1.6, transfira qualquer líquido restante no tubo C para o filtro de células.
- Transfira o líquido filtrado para um tubo de 15 ml usando uma ponta de micropipeta de 1 ml. Guarde temporariamente o filtro de células e seu tubo de 50 ml.
- Enxágue o tubo C com mais 3 ml de meio e transfira-o, novamente usando a mesma pipeta Pasteur da etapa 1.6, para o filtro de células ainda encaixado no tubo de 50 ml. Esprema uma quantidade máxima do líquido residual retido no tecido não homogeneizado no tubo de 50 ml, movendo-o suavemente ao redor do filtro com uma pipeta Pasteur limpa ou uma ponta de 1 ml que é posteriormente jogada fora para evitar a contaminação do eluato.
- Coloque o filtro de células de cabeça para baixo no tubo C original e enxágue com 3 ml de meio para que o tecido não homogeneizado caia de volta no tubo C.
- Homogeneizar novamente como na etapa 1.7 para dois ciclos do programa A.01.
- Despeje este segundo homogeneizado através do filtro de células assentado no tubo de 50 ml, lave novamente o tubo C com 3 ml de meio (como na etapa 1.10) e transfira com a pipeta Pasteur para o filtro de células assentado no tubo de 50 ml, espremendo novamente uma quantidade máxima de líquido do tecido conjuntivo residual preso no filtro de células.
- Neste ponto, um volume de ~2,5 ml está no tubo de 15 ml e ~9 ml no tubo de 50 ml.
2. Separação do sobrenadante do tecido e das células
- Centrifugar os homogeneizados nos tubos de 15 ml e 50 ml durante 15 min a 600 x g à temperatura ambiente.
- Transvasar o SN do tubo de 15 ml para um tubo limpo e conservá-lo temporariamente a 4 °C. Este sobrenadante = tumor primário, NANT ou SN de tecido normal (volume final de 2,5 ml) é subsequentemente clarificado e aliquotado antes do armazenamento a -80 °C para análises futuras (ver abaixo).
- Rejeitar o sobrenadante do tubo de 50 ml.
- Ressuspenda suavemente os dois grânulos celulares em um volume final de 1 ml de meio. Resumidamente, primeiro quebre suavemente o pellet celular em ambos os tubos (batendo o tubo em uma superfície dura). Ressuspender o sedimento de células soltas nos 50 ml com 500 μl de meio e transferir esta suspensão celular para o tubo de 15 ml para ressuspender o segundo sedimento. Repita esta etapa uma vez com os segundos 500 μl de meio para recuperação máxima das células.
- Transferir 10 μl da suspensão celular para um tubo pequeno, misturar com 10 μl de azul de tripano (diluição 1:1) e contar o número de células viáveis usando um hemocitômetro.
nota: Neste ponto, uma fração da suspensão celular também pode ser analisada por citometria de fluxo para avaliar o tamanho da célula, granularidade e, se desejado, um número limitado de marcadores de subpopulação para uma avaliação mais precisa da distribuição celular relativa no homogeneizado antes de uma análise ou experimentação extensiva. Todas as análises por citometria de fluxo incorporam marcação CD45 para normalização de subpopulações.
- Pulverizar as células por centrifugação a 300 x g durante 10 min à temperatura ambiente. As células do tumor, NANT ou tecido normal estão agora prontas para purificação ou análise adicional. Essas etapas adicionais são melhores quando realizadas no mesmo dia da cirurgia.
nota: Para análise por citometria de fluxo, mas não para classificação celular, os glóbulos vermelhos residuais devem ser lisados após a marcação de anticorpos, adicionando 0,4 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos ao pellet celular, imediatamente vórtice por 1 segundo e incubação por um mínimo de 10 min em temperatura ambiente (protegido da luz) antes da análise.
3. Clarificação do sobrenadante tecidual
- Centrifugue os tubos de 1,5 ml com tecido SN a 15.000 x g por 15 min a 4 °C.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante sem tocar ou perturbar o pellet. Transfira para um tubo (ou tubos) limpo, dependendo do número e volume de alíquotas desejadas.
- Conservar o sobrenadante a -80 °C para utilização futura.
