Ensaio de formação de colônias de ágar mole: um método para testar os efeitos de novos compostos na proliferação de células cancerígenas

Resumo

Fonte: Horibata A. et. al., Utilização do ensaio de formação de colônias de ágar mole para identificar inibidores da tumorigenicidade em células de câncer de mama. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo descreve um ensaio de formação de colônias de ágar mole para testar os efeitos de um inibidor da enzima PADI e BB-Cl-amidina na tumorigenicidade do câncer de mama in vitro. Este ensaio também permite a avaliação quantitativa do potencial de transformação celular no contexto de perturbações genéticas.

Protocolo

1. Preparação de 2-hidroxietil agarose a 3%

1. Em um frasco de vidro limpo e seco de 100 ml, adicione 0,9 g de 2-hidroxietilagarose (Agarose VII) seguido de 30 ml de água destilada.
2. Microondas a mistura por 15 segundos e agite suavemente. Repita esta etapa pelo menos mais três vezes até que o pó de agarose se dissolva completamente.
3. Autoclave o frasco contendo solução por 15 min.
4. Deixe a solução de agarose esfriar até RT antes de usá-la novamente. Armazene a solução no RT.

2. Preparação da camada inferior: 0,6% de gel de agarose

1. Pré-aqueça várias pipetas de 5 ml e 10 ml em uma incubadora a 37 °C para evitar que a agarose solidifique na pipeta durante o manuseio.
2. Afrouxe parcialmente a tampa do frasco e leve ao micro-ondas a solução pré-fabricada de agarose 2-hidroxietil a 3% por 15 segundos. Em seguida, gire suavemente a solução e leve ao microondas por mais 15 seg.
   cuidado: Tenha cuidado ao agitar a solução de agarose, pois a solução sobe quando exposta ao ar e pode transbordar.
3. Se houver gel sólido residual no frasco, leve ao microondas por mais alguns segundos.
4. Manter o frasco que contém a solução de agarose num banho-maria a 45 °C durante os passos seguintes para evitar que a solução de agarose solidifique prematuramente.
5. Aqueça MCF10DCIS em banho-maria a 37 °C.
   nota: MCF10DCIS meio consiste em DMEM/F12, soro de cavalo a 5%, estreptomicina de penicilina a 5%.
6. Transfira 3 ml da solução de agarose a 3% usando as pipetas pré-aquecidas para um tubo cônico estéril de 50 ml.
7. Adicione imediatamente 12 ml de meio MCF10DCIS quente e inverta suavemente o tubo cônico para misturar a agarose com o meio. Tente não formar bolhas, pois isso interferirá na contagem de colônias mais tarde.
8. Adicione delicadamente 2 ml desta mistura em cada poço de uma placa de cultura de 6 poços sem formar bolhas de ar.
9. Incube a placa de cultura de 6 poços horizontalmente em uma superfície plana a 4 ° C por 1 hora para permitir que a mistura solidifique.
10. Depois que a mistura solidificar, coloque a placa em uma incubadora a 37 °C por 30 min. A camada inferior agora está pronta para uso.

3. Preparação da camada contendo células: 0,3% de gel de agarose

1. Tripsinizar MCF10DCIS células e diluí-las até uma concentração celular de 4 x 10⁴ /ml.
2. Tome 2 ml de agarose a 3% usando pipetas pré-aquecidas e transfira para um tubo cônico estéril de 50 ml.
3. Adicione imediatamente 8 ml de MCF10DCIS meio ao tubo cônico e inverta suavemente para misturar a agarose com o meio. Evite formar bolhas.
4. Pegue 2 ml das células MCF10DCIS (4 x 10⁴ / ml) e trate com BB-CLA (0 μM (DMSO) ou 1 μM).
5. Em uma diluição de 1:1, misture as células com agarose a 0,6%.
6. Pegue 1 ml da mistura de célula e agarose e adicione suavemente na camada inferior da placa de cultura de 6 poços (2 x 10⁴ células / ml).
7. Coloque a placa de cultura de 6 poços horizontalmente em uma superfície plana a 4 ° C por pelo menos 15 min para permitir que a camada superior solidifique.
8. Depois que a mistura solidificar, coloque a placa em uma incubadora a 37 ° C por uma semana antes de adicionar a camada de alimentação.

4. Preparação da camada alimentadora: 0,3% de gel de agarose

1. Microondas a solução pré-fabricada de agarose 2-hidroxietil a 3% por 15 segundos. Gire suavemente a solução e leve ao microondas por mais 15 segundos.
2. Equilibre o frasco de solução de agarose em banho-maria a 45 °C.
3. Aquecer o meio MCF10DCIS em banho-maria a 37 °C.
4. Misture 1 ml de solução de agarose a 3% com 9 ml de meio de MCF10DCIS quente em um tubo cônico de 50 ml e inverta suavemente para misturar a agarose com o meio. Evite formar bolhas de ar.
5. Trate a mistura com BB-CLA (0 μM (DMSO) ou 1 μM).
6. Adicione delicadamente 1 ml desta mistura (sem formar bolhas) em cada poço da placa de cultura de 6 poços contendo o fundo e as camadas macias.
7. Coloque a placa de cultura de 6 poços horizontalmente em uma superfície plana a 4 °C por pelo menos 15 min para permitir que a mistura solidifique.
8. Depois que a camada de alimentação solidificar, coloque a placa em uma incubadora a 37 °C.
9. Repita este procedimento de alimentação semanalmente, sobrepondo 1 ml de agarose/meio/solução de tratamento a 0,3% na camada alimentadora existente para reabastecer as células com novos meios até que a formação de colônias seja observada.
   nota: O ágar nas camadas macia e alimentadora é muito macio e, portanto, os nutrientes adicionados da camada alimentadora se difundirão prontamente na camada contendo células para alcançar as células.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Zeiss Axiopot	Microscopia Carl Zeiss	1021859251
Microscópio invertido	Olimpo	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Doador Equino Serum	Fisher Científico	SH30074.03
Penicilina estreptomicina	Tecnologias da Vida	15140-122
2-Hidroxietilagarose: Tipo VII, baixa temperatura de gelificação	Sigma-Aldrich	Rolamento 39346-81-1