Injeção na veia da cauda: um método para administrar células cancerígenas para estudos metastáticos em um modelo de camundongo

Resumo

Fonte: Warren et. al., Uso combinado de ensaios de metástase da veia da cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e a carga nos pulmões. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve uma técnica de injeção de células cancerígenas marcadas usando injeção de veia da cauda em um modelo de camundongo. Além disso, monitoramos a formação e o crescimento de metástases de câncer de mama usando imagens de animais vivos in vivo em tempo real.

Protocolo

1. Injeção na veia da cauda de células cancerígenas marcadas

NOTA: A etapa 1.2.4 foi otimizada para células 4T1 que crescem em camundongos BALB/c singênicos. Se outras linhagens de células cancerígenas e cepas de camundongos forem usadas, o número de células injetadas e a duração do ensaio devem primeiro ser otimizados.

1. Expandir as linhas celulares 4T1 geradas no passo 2 em duas placas de 15 cm em meios de cultura completos, de modo a que as células excedentárias estejam disponíveis no dia da injeção.
2. Prepare as células para a injeção na veia da cauda da seguinte forma:
   1. Aspire o meio e enxágue as placas celulares com 1x PBS.
   2. Tripsinize as células com 5 mL de tripsina por placa de 15 cm por 2-5 minutos (as células devem enxaguar livremente o fundo do poço). Transfira todas as células para um tubo cônico. Lave as células restantes da placa de cultura de tecidos com meio de crescimento completo suficiente para extinguir a tripsina e adicione a lavagem ao mesmo tubo cônico.
   3. Conte as células usando um contador de células automatizado para determinar o número total de células.
   4. Centrifugue as células a 122 x g por 3 minutos, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 1x PBS na concentração desejada. Aqui, 2,5 x 10⁴ células são injetadas em cada camundongo em 100 μL de PBS, de modo que as células ressuspendem a 2,5 x 10⁵ células / mL. Mantenha as suspensões celulares congeladas até a injeção.
      NOTA: é importante limitar a quantidade de tempo entre a tripsinização das células e a injeção da veia da cauda a cerca de 1 hora.
3. Injetar células 4T1 do passo 1.2.5 em ratinhos através da veia lateral da cauda do seguinte modo:
   1. Trabalhando em um capuz na biotérica, misture as células de maneira suave, mas completa, invertendo o tubo ou usando uma seringa de 1 mL para garantir que sejam ressuspensas uniformemente. Certifique-se sempre de que as células sejam ressuspensas antes de carregar a seringa.
   2. Carregue uma seringa Luer-lock de 1 mL com suspensão celular e expulse o excesso de bolhas de ar. Coloque uma agulha de calibre 30 de 1/2 polegada na seringa com o chanfro para cima e expulse as bolhas de ar.
   3. Coloque suavemente o mouse em um limitador de roedores.
   4. As veias laterais da cauda devem estar visíveis e dilatadas. Caso contrário, aperte suavemente a base da cauda e mergulhe a cauda em água morna da torneira para dilatar as veias.
      nota: A dilatação das veias também pode ser alcançada colocando a gaiola do rato sob uma lâmpada de aquecimento e/ou em cima de uma almofada de aquecimento.
   5. Use um lenço umedecido com álcool para limpar a cauda. Insira a agulha na veia da cauda, com o lado chanfrado para cima, e injete 100 μL de suspensão celular.
      nota: Se a agulha for inserida corretamente na veia, ela deve deslizar facilmente ligeiramente para frente e para trás, e não deve haver resistência quando o êmbolo é empurrado. As injeções bem-sucedidas também devem resultar em um "rubor" no qual a cor azul da veia fica branca por alguns segundos após a injeção.
4. Remova lentamente a agulha e, usando uma gaze estéril, aplique pressão no local da injeção para parar qualquer sangramento.
5. Retorne o mouse à gaiola e monitore por 15 minutos para garantir a recuperação total. Os camundongos devem ser verificados quanto a sinais de dor ou angústia 3x por semana.
6. Monitore os camundongos quanto à formação e crescimento de metástases por 3-6 semanas (dependendo da linhagem celular e da cepa do camundongo) usando um dispositivo de imagem de animais vivos in vivo (consulte as etapas 1.5 e 1.6).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2,5% de tripsina	Gibco	15090-046	Tripsina para cultura de tecidos
Toalhetes com álcool			Para esterilizar o local da injeção antes das injeções da veia da cauda
Camundongos BALB/C (fêmea, 6 semanas)	Taconic	BALB-F	Para colonização metastática da veia da cauda e ensaios de carga
Dulbecco&39; s solução salina tamponada com fosfato	Himídia	TS1006
Edta	VWR	Rolamento 97061-406	Usado para diluir tripsina para cultura de tecidos
FBS 100% de origem americana	VWR	Rolamento 97068-085	Componente de meios de crescimento completos
L-Glutamina	Gibco	Rolamento 25030-081	Componente de meios de crescimento completos
Células de câncer de mama de camundongo, 4T1	Instituto do Câncer Karmanos	Aslakson, CJ et al., 1992	Linha celular de vaso mamário metastático de camundongo
Penicilina estreptomicina	Gibco	15140-122	Componente de meios de crescimento completos