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Ensaio de imunofluorescência CTC: uma técnica para caracterizar células tumorais circulantes

30 de abril de 2023

Neste artigo

Resumo

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Fonte: Garcia, J., et al. Caracterização e Enumeração Semiautomática de PD-L1 de Células Tumorais Circulantes de Pacientes com Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas por Imunofluorescência.J. Vis. Exp.(2019)

Este vídeo descreve o ensaio de imunofluorescência de células tumorais circulantes (CTC), uma técnica para caracterizar os biomarcadores em células tumorais circulantes em amostras de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas. Este ensaio pode ser usado para monitorar mudanças dinâmicas do tumor e resposta imune, que podem refletir a resposta à quimioterapia, radiação e possíveis tratamentos de imunoterapia.

Protocolo

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1. Coloração por imunofluorescência

  1. Enumere em uma lâmina com câmara com uma grade do tipo hemocitômetro o número de células por mL. Dilua a amostra enriquecida com solução anti-ligação a 0,2% (Tabela de Materiais) até uma concentração que atinja 100.000 células/100 μL por citospina.
  2. Umedeça o contorno da câmara de amostra usando algodão (Tabela de Materiais) com 50 μL de solução anti-ligação a 0,2%. Colocar uma lâmina de vidro de polilisina na câmara de recolha e fechar.
  3. Cubra uma ponta com solução anti-ligação a 0,2% pipetando para cima e para baixo 3x. Ressuspenda a amostra enriquecida e transfira a solução celular para a câmara de amostra. Centrífuga com centrífuga dedicada (Tabela de Materiais) a 400 rpm por 4 min (aceleração baixa).
  4. Coloque um isolador de silício ao redor da área de deposição. Deixe secar a lâmina de vidro sob uma cabine de segurança microbiológica por 2 min.
  5. Prepare a solução de fixação diluindo 1 mL de paraformaldeído a 16% (PFA) com 3 mL de PBS estéril. Adicionar 100 μL de solução de fixação (4% de PFA) por amostra e incubar em RT por 10 min. Remover a solução de fixação e realizar três lavagens com 200 μL de PBS e incubar em RT cada uma por 2 min.
    CUIDADO: Use PFA sob um gabinete de segurança química para evitar a inalação.
  6. Prepare a solução de saturação diluindo o soro fetal bovino (FBS) a 5%, o reagente bloqueador do receptor Fc (FcR) a 5% e a albumina de soro bovino (BSA) a 1% em PBS estéril (Tabela de Materiais). Adicionar 100 μL de solução de saturação por amostra e incubar durante 30 min a RT. Remover a solução de saturação.
  7. Adicione 100 μL de solução de anticorpo por amostra (anticorpo CD45 1/20; Anticorpo PanCK 1/500; anticorpo PD-L1 1/200; Solução de saturação Qsp 100 μL) (Tabela de Materiais). Colocar a lâmina de vidro de polilisina numa placa de Petri de 100 mm x 15 mm. Umedeça um papel absorvente com 2 mL de água estéril e feche a placa de Petri com a tampa. Coloque a 4 °C durante a noite e proteja da luz.
  8. Remova a mistura de anticorpos e realize 3 lavagens com 200 μL de PBS incubando cada lavagem por 2 min. Deixe a amostra secar por 5 min e proteja-a da luz. Coloque 10 μL de solução de montagem (Tabela de Materiais) na área de deposição e cubra com uma lamínula de microscópio sem formar bolhas. Sele a lamínula com esmalte.

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Plurônico F-68 10% Gibco Rolamento 24040-032Solução anti-ligação. Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
EZ Citofunis ThermoFisherA78710003Câmara de amostra com algodão. Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
Centrífuga Shandon Cytopsin4ThermoFisher A78300003Centrífuga dedicada. Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
Paraformaldeído 16%ThermoFisher 11490570Solução de fixação. Condições de armazenamento: + 4 ° C
Fosfato tamponado solução salina ultra puro grau 1X - 1L1º Laboratório de BaseBUF-2040-1X1LCondições de armazenamento: Temperatura ambiente
Agente de bloqueio FcR Miltenyi Biotec130-059-901Condições de armazenamento: + 4 ° C
Anticorpo monoclonal PD-L1 (clone 29E2A3) - FicoeritrinaBioLegend BLE329706 Condições de armazenamento: + 4 ° C
Anticorpo monoclonal PanCK (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488ThermoFisherRolamento 53-9003-80 Condições de armazenamento: + 4 ° C
Anticorpo monoclonal CD45 (clone HI30) Alexa Fluor 647BioLegend BLE304020Condições de armazenamento: + 4 ° C
Montagem fluorada sigma Rolamento F4680Solução de montagem. Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
Placa de PetriDutscherNº 632180Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)OzymeBE17-512FCondições de armazenamento: + 4 ° C
Lâminas de polilisina ThermoFisherJ2800AMNZCondições de armazenamento: Temperatura ambiente
Isolador de silício Grace bio-Labs Nº 664270Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
Água Deionizada Estéril – 100 mL1º Laboratório de Base CUS-4100-100ml Condições de armazenamento: Temperatura ambiente
Soro fetal de bezerro (FCS)Gibco10270-106Condições de armazenamento: + 4 ° C

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