Insuflação de agarose de pulmão inteiro: um método de preparação de pulmões para imagens ao vivo ex vivo

Resumo

Fonte: Van den Bijgaart R.J.E. et al., Ex vivo Imagens ao vivo de metástases pulmonares e seu microambiente, J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo descreve um método de preparação de pulmões para imagens ao vivo ex vivo para estudar as interações entre células cancerígenas e células estromais, usando agarose para inflação. No protocolo de amostra, o procedimento de insuflação de agarose é descrito antes de observar as interações celulares ao vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação de pulmões para imagens ao vivo ex vivo

NOTA: Tente trabalhar o mais estéril e cuidadoso possível para evitar desafios desnecessários das células imunológicas dentro dos pulmões.

1. Injete no camundongo por via intraperitoneal (i.p.) uma overdose letal de um anestésico permitido pelo protocolo animal aprovado pela IACUC, por exemplo,., 1 ml de Avertina a 2,5%. Espere que ....

Resultados

Figura 1. Protocolo para preparo de pulmões para imagens ao vivo.(A) Exposição da traqueia após a preparação do camundongo. (B) Pequeno recorte feito na traqueia exposta paralela aos anéis cartilaginosos. (C) Agulha de 20 G inserida 4-5 mm na traqueia. (D) Instilação de 400 μl de agarose a 2% de baixa temperat.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
anestésico	NA	NA	Anestesia aprovada pela IACUC, usada para anestesia e/ou eutanésia
PBS, USP estéril	Amresco INC	K813-500ML	Grau ultra puro para injeção intravenosa
1X PBS	Instalação de cultura de células da UCSF	NA
Plataforma de isopor	NA	NA	Será usado como placa de dissecação
Tesoura fina afiada	Ferramentas de Belas Ciências	14060-11
20 G x 1 agulha, bisel curto	Bd	305178
fórceps	Loja Cirúrgica Roboz	RS-5135
Seringa de 1 mL sem agulha	Bd	309659
Agarose de baixa temperatura de fusão	Lonza	Rolamento 50111	Para fazer 10 ml de solução, pesar 0,2 g de agarose, adicionar a 10 ml 1 x PBS e aquecer para dissolver. A agarose solidifica à temperatura ambiente, portanto, mantenha em banho-maria a 37 °C até ser usada para inflação.
Meio RPMI-1640 sem vermelho de fenol	Tecnologias da Vida	11835-030
Placa de imagem de 24 poços	E&K científica	EK-42892
Corrediças de cobertura de vidro, 15 mm	Fisher Científico	22-031-144
Controlador digital de CO2 e temperatura	Okolab	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
Câmara climática	Okolab	NA	http://www.oko-lab.com
Microscópio confocal de disco giratório Cell Observer	Zeiss	NA
ar	Ucsf	NA
oxigénio	Ucsf	NA
dióxido de carbono	Ucsf	NA