Insuflação de agarose de pulmão inteiro: um método de preparação de pulmões para imagens ao vivo ex vivo

Neste artigo

Resumo

Fonte: Van den Bijgaart R.J.E. et al., Ex vivo Imagens ao vivo de metástases pulmonares e seu microambiente, J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo descreve um método de preparação de pulmões para imagens ao vivo ex vivo para estudar as interações entre células cancerígenas e células estromais, usando agarose para inflação. No protocolo de amostra, o procedimento de insuflação de agarose é descrito antes de observar as interações celulares ao vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação de pulmões para imagens ao vivo ex vivo

NOTA: Tente trabalhar o mais estéril e cuidadoso possível para evitar desafios desnecessários das células imunológicas dentro dos pulmões.

Injete no camundongo por via intraperitoneal (i.p.) uma overdose letal de um anestésico permitido pelo protocolo animal aprovado pela IACUC, por exemplo,., 1 ml de Avertina a 2,5%. Espere que o mouse pare de respirar e não responda completamente a estímulos nocivos (pinça da pata traseira).
NOTA: A luxação cervical e a eutanásia com dióxido de carbono devem ser evitadas, pois podem afetar negativamente a viabilidade das células pulmonares.
Imobilize o camundongo em uma placa de dissecação e esterilize o camundongo com etanol a 70%.
Use uma tesoura cirúrgica para fazer primeiro uma incisão epigástrica transversal através da pele, seguida por uma incisão semelhante através do peritônio. Segure a placa de dissecção na posição vertical e corte a aorta descendente, de modo que o sangue se acumule no abdômen e não na cavidade torácica.
Corte uma pequena abertura no diafragma para liberar o vácuo. Corte ao longo da 10ª e 12ª costelas para extirpar o diafragma e obter acesso visual aos pulmões.
Use uma tesoura cirúrgica para cortar a pele até a traqueia sobre a caixa torácica, mas deixe a caixa torácica intacta. Separe a pele da caixa torácica. Exponha a traqueia removendo o tecido conjuntivo circundante, tomando cuidado para não danificar a própria traqueia (Figura 1A).
Corte uma pequena abertura de aproximadamente 1 mm de diâmetro na traqueia exposta paralela aos anéis cartilaginosos, o mais próximo possível da laringe (Figura 1B). Tenha cuidado para não cortar completamente a traqueia.
Pegue uma agulha de 20 G e insira suavemente a agulha 4-5 mm na traqueia sem qualquer força contrária (Figura 1D). A extremidade da agulha deve ser visível através da traqueia (Figura 1C). Use uma pinça para estabilizar a agulha na traqueia. Alternativamente, uma sutura pode ser amarrada ao redor da traqueia para manter a agulha no lugar.
NOTA: Ao inserir muito fundo, a carina pode ficar traumatizada ou apenas um lado dos pulmões pode ser inflado.
Encher uma seringa com 400 μl de agarose a 37 °C a 2% a baixa temperatura de fusão (retirada directamente de um banho de temperatura constante). Certifique-se de que a placa de dissecção esteja em pé e instile lentamente a agarose quente através da agulha nos pulmões, use ~ 400 μl para inflar os pulmões.
NOTA: Observe os pulmões inflando dentro da caixa torácica. Não infle demais o pulmão, pois ele se romperá.
Assim que os pulmões estiverem inflados, preenchendo ~ 2/3 da caixa torácica, retire a seringa e mantenha a agulha dentro da traqueia para evitar que qualquer agarose vaze.
Despeje aproximadamente 50 ml de PBS a 20 ° C sobre os pulmões inflados para permitir que a agarose dentro dos pulmões se fixe e solidifique. Remova lentamente a agulha e feche a traqueia com uma pinça para evitar que qualquer agarose não solidificada vaze.
Exponha os pulmões realizando uma esternotomia e, posteriormente, excise os pulmões. Para a excisão dos pulmões, segure a traqueia enquanto corta a traqueia completamente. Puxe suavemente a traqueia para cima, corte o tecido conjuntivo e o esôfago enquanto puxa os pulmões para fora da cavidade torácica até que os pulmões sejam separados do camundongo (Figura 1E).
Mergulhe os pulmões em RPMI-1640 quente para lavar o excesso de sangue e separe suavemente os lóbulos usando tesouras e fórceps para cortar o brônquio do tronco principal dos lobos no hilo (Figura 1F).
Coloque os lóbulos, com a superfície plana para baixo para maximizar a superfície de imagem, em um poço de uma placa de imagem de 24 poços (Figura 1G). Adicione 100 μl de RPMI-1640 a 37 °C no topo dos lóbulos. Coloque várias lâminas de cobertura de microscópio circular de 15 mm em cima dos lóbulos para evitar que flutuem.
Despeje PBS quente nos poços circundantes para evitar que o meio RPMI-1640 evapore. Insira a placa de 24 poços na câmara climática equilibrada e mantenha os lobos pulmonares a 37 ° C com ar e 5% de CO₂. Insira a câmara climática na platina do microscópio confocal.
NOTA: Outras misturas de gases (por exemplo, 5% O₂, 5% CO₂ em N₂ para examinar o comportamento celular em condições de hipóxia/menor oxigênio) também podem ser consideradas.

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Resultados

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Figura 1. Protocolo para preparo de pulmões para imagens ao vivo.(A) Exposição da traqueia após a preparação do camundongo. (B) Pequeno recorte feito na traqueia exposta paralela aos anéis cartilaginosos. (C) Agulha de 20 G inserida 4-5 mm na traqueia. (D) Instilação de 400 μl de agarose a 2% de baixa temperat...