1. Passagem e cultura de células TUM622 em culturas 2D
- Meio de cultura 3D quente e reagentes de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) para células TUM622 a 37 °C.
- Células TUM622 de passagem a 80% de confluência em frascos 2D. Normalmente, isso ocorre 1 semana após a morte.
- Descarte o meio antigo de um frasco T75 e lave uma vez com 6 mL de tampão HEPES. Evite pipetar diretamente nas células.
- Aspire o tampão HEPES. Adicione 4 mL de tripsina / EDTA (0,25 mg / mL, consulte a Tabela de Materiais) para um enxágue rápido e descarte a tripsina / EDTA.
- Adicione 2 mL de tripsina / EDTA e incube a 37 ° C por 5 min. Remova os frascos da incubadora e bata nos frascos para soltar as células sem criar bolhas de ar e retorne os frascos para a incubadora por mais 5 min.
nota: A exposição prolongada à tripsina danificará irreversivelmente as células e alterará seu fenótipo, portanto, recomenda-se limitar o tempo que as células são expostas à tripsina.
- Confirme se as células se desprenderam e se dissociaram sob um microscópio óptico (4x ou 10x). Adicione 4 mL de tampão de neutralização (tampão TNS) (consulte as informações do reagente de subcultura na Tabela de Materiais) seguido de 10 mL de meio de cultura 3D (consulte a Tabela de Materiais).
- Pipete para cima e para baixo suavemente para dissociar ainda mais as células usando uma pipeta de 10 mL. Transfira a suspensão através de um filtro de células de 40 μm para um tubo cônico de 50 mL.
- Conte o número de células usando um hemocitômetro ou contador de células automatizado.
- Semear 0,8 x 106 células/frasco T75 em 20 mL de meio de cultura 3D (ver Tabela de Materiais).
- Alimente as células em dias alternados, substituindo metade do meio gasto por meio fresco.
2. Revestimento de células TUM622 na matriz extracelular para cultura 3D
- No dia anterior ao experimento, descongele os frascos de matriz de membrana basal em uma geladeira a 4 ° C durante a noite. Pipetas de plástico de resfriamento (2 mL) e ponteiras a -20 °C durante a noite.
nota: Nem todos os lotes de matriz de membrana basal têm a mesma capacidade de suportar o crescimento 3D de células TUM622. Portanto, é necessário adquirir e testar vários lotes de matriz de membrana basal para identificar aqueles que suportam a formação robusta de ácinos. Normalmente, isso requer uma concentração de proteína mais alta (16-18 mg / mL) na matriz.
- No dia do experimento, meio de cultura 3D quente, tampão HEPES, tripsina/EDTA e tampão neutralização de tripsina (TNS) em banho-maria a 37 °C. Imediatamente antes de configurar a cultura, retire a matriz da membrana basal descongelada da geladeira e coloque o frasco no gelo.
- Resfrie as placas de cultura de tecidos em um refrigerador de plataforma de metal colocado no gelo. Coloque os tubos da centrífuga em uma prateleira de resfriamento de metal no gelo.
- Usando células TUM622 obtidas na etapa 1.7, calcule o número desejado de células necessárias para o revestimento. Normalmente, são necessárias 15.000-30.0000 células por poço de uma placa de 24 poços. A densidade mais baixa é mais adequada para imagens e quantificação, enquanto a densidade mais alta é preferida ao coletar células para extração de RNA ou western blotting.
- Transferir a suspensão da célula para um tubo de centrifugação arrefecido (cada tubo contendo células para triplicata) e centrifugar a 300 x g numa centrífuga de balde suspenso a 4 °C durante 5 min.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de aspiração acoplada a uma ponta não filtrada (20 μL), deixando cerca de 100 μL do meio no tubo (utilizar marcações no tubo como guia).
- Bata suavemente na lateral do tubo para desalojar e dissociar o pellet antes de devolvê-lo ao rack de resfriamento.
- Usando as pipetas pré-resfriadas de 2 mL, misture suavemente a matriz pipetando para cima e para baixo algumas vezes, mantendo o frasco em contato com o gelo. Pipete a uma velocidade uniforme e moderada para que não sejam introduzidas bolhas na matriz durante este procedimento.
- Transfira o volume apropriado da matriz para cada tubo de centrífuga. Para o revestimento de triplicados em uma placa de 24 poços, adicione 1,1 mL de matriz de membrana basal a cada tubo.
- Usando pontas pré-resfriadas, pipete a matriz em cada tubo para cima e para baixo cerca de 10 vezes para fazer uma suspensão celular uniforme.
- Transfira 310 μL de suspensão de célula/matriz para cada poço de uma placa pré-resfriada de 24 poços. A pipeta é colocada em um ângulo de 90° em relação à superfície da placa e a suspensão é adicionada ao centro do poço. A suspensão deve se espalhar e cobrir todo o poço sem a necessidade de inclinar a placa.
- Para facilitar a análise de imunofluorescência a jusante, coloque a suspensão célula/matriz em paralelo em lâminas de câmara de 2 poços. Transfira 100 μL de suspensão de célula/matriz para o centro de um poço de lâmina de câmara de 2 poços (consulte a Tabela de Materiais). Isso permite que a matriz forme uma estrutura semelhante a uma cúpula com volume muito menor.
- Retorne a placa e a lâmina da câmara de volta para uma incubadora de cultura de tecidos e incube por 30 minutos para permitir que a matriz solidifique. Examine a placa/lâmina sob um microscópio óptico para garantir que as células individuais sejam distribuídas uniformemente dentro da matriz (4x ou 10x).
- Adicione 1 mL de meio completo de cultura 3D pré-aquecido em cada poço e 1,5 mL de meio de cultura 3D a cada poço da lâmina da câmara e, em seguida, devolva-os à incubadora.
