Ensaio de extração de RNA: um método para extrair RNA de células de câncer de pulmão transfectadas com miRNA

Resumo

Fonte: Hossian, A. K. M. N. et al., Análise de Tratamentos Combinatórios de miRNA para Regular o Ciclo Celular e a Angiogênese. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve o protocolo de extração de RNA de células de câncer de pulmão transfectadas com miRNA. Essa abordagem pode ser usada para identificar uma atividade de tratamento combinatório de miRNA na interrupção do ciclo celular e da angiogênese.

Protocolo

1. transfecção de miR-143 e miR-506

CUIDADO: Use luvas de látex, óculos de proteção e jaleco de laboratório durante a realização dos experimentos descritos. Quando necessário, use o gabinete de biossegurança com o ventilador do gabinete ligado, sem bloquear as vias aéreas ou perturbar o fluxo de ar laminar. Sempre ajuste a janela de vidro de proteção na altura apropriada, conforme descrito pelo fabricante.

1. Semear células NSCLC A549 em um frasco T25 cm²/placa de 6/96 poços em meio DMEM/F12K suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (meio de cultura) em uma capa de cultura de tecidos e incubar durante a noite a 37 °C com 5% de CO₂ em uma incubadora de cultura de tecidos.
2. Suspenda os imitadores de miR-143 e/ou miR-506, ou embaralhe siRNA com agente transfectivo (2,4 μg de miR foram misturados com 14 μL de agente transfectador; ver Tabela de Materiais) em 500 μL de meio de transfecção e 1,5 mL de soro e meio DMEM/F12K livre de antibióticos em uma concentração final de miRNA de 100 nM. A quantidade de miRNA pode exigir otimização em diferentes células e concentrações. Abordagens apropriadas incluem a transfecção de células com concentrações crescentes de miRNA (ou seja, 50-200 nM) e avaliação da regulação negativa da expressão dos genes de interesse.
3. Remova o meio de cultura do frasco/placa e lave uma vez com 1x PBS.
4. Adicionar complexos de miRNA/agente transfectador de embaralhamento e incubar a 37 °C com 5% de CO₂ durante 6 h (o tamanho do frasco define o volume de incubação adicionado).
5. Substitua o meio por 4 mL de meio de cultura e incube as células por 24 h e / ou 48 h.
6. Colha as células transfectadas por tripsinização, adicionando 1 mL de tripsina-EDTA em cada frasco T25 cm², incube por 5-10 min a 37 ° C e adicione 3 mL de meio de cultura para colher as células. Colocar o conteúdo de cada balão num tubo separado de 15 ml marcado. Trabalhe em uma coifa de cultura de tecidos.
7. Centrifugue a 751 x g por 5 min e remova o sobrenadante.
   nota: É necessário cuidado durante a remoção do sobrenadante, pois a agitação do tubo pode causar perda de células.
8. Adicione 2 mL de 1x PBS e centrifugue por 5 min a 751 x g.
9. Repita as etapas 7 e 8 uma vez para remover quaisquer vestígios de mídia e supernatant.
   nota: Nesta fase, os tubos de amostra podem ser armazenados a -80 °C ou podem ser usados imediatamente.

2. Extração de RNA

1. Limpe a área de trabalho pulverizando com álcool isopropílico 70% e solução de descontaminação de RNAse.
2. A extração de RNA deve ser realizada usando um kit de RNA apropriado (consulte a Tabela de Materiais).
3. Remova os tubos de -80 °C e deixe-os descongelar. Adicione 300 μL de tampão de lise e pipete para cima e para baixo para quebrar a membrana celular.
4. Adicione um volume igual de etanol 100% ultrapuro.
5. Misture bem e coloque na coluna de separação.
6. Centrifugue entre 11 e 16 x g por 30 s e remova o fluxo.
7. Adicione 400 μL de tampão de lavagem e centrifugue para remover o tampão.
8. Adicione 5 μL de DNAse I com 75 μL de tampão de digestão de DNA em cada amostra e incube por 15 min.
9. Lave a amostra com 400 μL de tampão de preparação de RNA.
10. Lave 2x com tampão de lavagem de RNA.
11. Adicione água livre de nuclease à coluna, centrifugue e colete o RNA.
12. Meça a concentração total de RNA com um espectrofotômetro UV.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
A549 Células de Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas	ATCC	ATCC CCL-185
Silenciador Ambion Controle Negativo No. 1 siRNA	Ambion	AM4611
miRNA has-miR-143-3p MiRNA Mimic	Abm	MCH01315
miRNA has-miR-506-3p Mimic	Abm	MCH02824
Soro fetal bovino (FBS)	Fisher Científico	10438026
HyClone Fosfato Tampolado Salino (PBS)	Fisher Científico	SH30256FS
DMEM 4,5 g/L de glicose, sem piruvato de sódio, sem L-glutamina	VWR	VWRL0100-0500
Água destilada sem RNase Invitrogen UltraPure DNase / RNase	Invitrogen	Telefone: 10-977-015
Kits de RNA rápido	Pesquisa Zymo	R1055
Etanol Absoluto (200 Provas), Grau de Biologia Molecular,	BioReagentes Fisher	BP2818500
-80 °C Congelador	VWR	VWR40086A
Nanodrop	Thermo Científico	NanoDrop um C
Placa de 96 poços	CELLTREAT Científico	Telefone: 50-607-511
Penicilina-estreptomicina 10/10	Antlanta Biológicos	B21210
Incubadora de CO2	Thermo Científico	HERAcell 150i
dnase	Pesquisa Zymo	E1010
Mistura de nutrientes F-12K (Mod de Kaighn) com L-glutamina, Corning	Corning	Rolamento 45000-354
Soro Fetal Bovino - Premium	Antlanta Biológicos	S11150
Matchine de centrífuga com temperatura controlada	Thermo Científico	ST16R
Matchine de microcentrífuga com temperatura controlada	Eppendrof	5415R