1. transfecção de miR-143 e miR-506
CUIDADO: Use luvas de látex, óculos de proteção e jaleco de laboratório durante a realização dos experimentos descritos. Quando necessário, use o gabinete de biossegurança com o ventilador do gabinete ligado, sem bloquear as vias aéreas ou perturbar o fluxo de ar laminar. Sempre ajuste a janela de vidro de proteção na altura apropriada, conforme descrito pelo fabricante.
- Semear células NSCLC A549 em um frasco T25 cm2/placa de 6/96 poços em meio DMEM/F12K suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (meio de cultura) em uma capa de cultura de tecidos e incubar durante a noite a 37 °C com 5% de CO2 em uma incubadora de cultura de tecidos.
- Suspenda os imitadores de miR-143 e/ou miR-506, ou embaralhe siRNA com agente transfectivo (2,4 μg de miR foram misturados com 14 μL de agente transfectador; ver Tabela de Materiais) em 500 μL de meio de transfecção e 1,5 mL de soro e meio DMEM/F12K livre de antibióticos em uma concentração final de miRNA de 100 nM. A quantidade de miRNA pode exigir otimização em diferentes células e concentrações. Abordagens apropriadas incluem a transfecção de células com concentrações crescentes de miRNA (ou seja, 50-200 nM) e avaliação da regulação negativa da expressão dos genes de interesse.
- Remova o meio de cultura do frasco/placa e lave uma vez com 1x PBS.
- Adicionar complexos de miRNA/agente transfectador de embaralhamento e incubar a 37 °C com 5% de CO2 durante 6 h (o tamanho do frasco define o volume de incubação adicionado).
- Substitua o meio por 4 mL de meio de cultura e incube as células por 24 h e / ou 48 h.
- Colha as células transfectadas por tripsinização, adicionando 1 mL de tripsina-EDTA em cada frasco T25 cm2, incube por 5-10 min a 37 ° C e adicione 3 mL de meio de cultura para colher as células. Colocar o conteúdo de cada balão num tubo separado de 15 ml marcado. Trabalhe em uma coifa de cultura de tecidos.
- Centrifugue a 751 x g por 5 min e remova o sobrenadante.
nota: É necessário cuidado durante a remoção do sobrenadante, pois a agitação do tubo pode causar perda de células.
- Adicione 2 mL de 1x PBS e centrifugue por 5 min a 751 x g.
- Repita as etapas 7 e 8 uma vez para remover quaisquer vestígios de mídia e supernatant.
NOTA: Nesta fase, os tubos de amostra podem ser armazenados a -80 °C ou podem ser usados imediatamente.
2. Análise do ciclo celular
- Semear 5 x 105 células para cada amostra num balão T25 cm2 e efectuar uma transfecção de acordo com o protocolo descrito na secção 1, passos 1-5.
- Após 24 h e 48 h, colher as células por tripsinização.
- Transfira as suspensões celulares para tubos estéreis de 15 mL e rotule-os corretamente.
- Centrifugue as amostras a 751 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante.
- Adicione 2 mL de 1x PBS gelado, vórtice e centrifugue a 751 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante.
- Repita a etapa de lavagem com 1x PBS para remover a mídia residual.
- Ressuspenda e quebre o pellet adicionando 200 μL de 1x PBS gelado por pipetagem.
- Fixe as células adicionando 2 mL de etanol gelado a 70% gota a gota ao tubo enquanto vórtice suavemente.
- Incubar os tubos durante 30 min em RT e colocar os tubos a 4 °C durante 1 h.
- Retirar os tubos a 4 °C e centrifugar a 751 x g durante 5 min.
- Adicione 2 mL de 1x PBS gelado, vórtice e centrifugue a 751 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante.
- Adicione 500 μL de 1x PBS com iodeto de propídio (50 μg/mL) e ribonuclease A (200 μg/mL).
- Incube por 30 min em RT enquanto protege as amostras da luz.
- Adquira dados sobre citômetro de fluxo. Use a dispersão direta vs. lateral (FSC vs. SSC) para selecionar a população principal de células, excluindo detritos no canto inferior esquerdo do gráfico de densidade FSC vs. SSC e aglomerados de células no lado superior para o lado superior direito do gráfico de densidade FSC vs. SSC.
- Analise os dados para identificação de populações de células por estágio do ciclo celular com o software apropriado.