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1. transfecção de miR-143 e miR-506
CUIDADO: Use luvas de látex, óculos de proteção e jaleco de laboratório durante a realização dos experimentos descritos. Quando necessário, use o gabinete de biossegurança com o ventilador do gabinete ligado, sem bloquear as vias aéreas ou perturbar o fluxo de ar laminar. Sempre ajuste a janela de vidro de proteção na altura apropriada, conforme descrito pelo fabricante.
- Semear células NSCLC A549 em um frasco T25 cm2/placa de 6/96 poços em meio DMEM/F12K suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (meio de cultura) em uma capa de cultura de tecidos e incubar durante a noite a 37 °C com 5% de CO2 em uma incubadora de cultura de tecidos.
- Suspenda os imitadores de miR-143 e/ou miR-506, ou embaralhe siRNA com agente transfectivo (2,4 μg de miR foram misturados com 14 μL de agente transfectador; ver Tabela de Materiais) em 500 μL de meio de transfecção e 1,5 mL de soro e meio DMEM/F12K livre de antibióticos em uma concentração final de miRNA de 100 nM. A quantidade de miRNA pode exigir otimização em diferentes células e concentrações. Abordagens apropriadas incluem a transfecção de células com concentrações crescentes de miRNA (ou seja, 50-200 nM) e avaliação da regulação negativa da expressão dos genes de interesse.
- Remova o meio de cultura do frasco/placa e lave uma vez com 1x PBS.
- Adicionar complexos de miRNA/agente transfectador de embaralhamento e incubar a 37 °C com 5% de CO2 durante 6 h (o tamanho do frasco define o volume de incubação adicionado).
- Substitua o meio por 4 mL de meio de cultura e incube as células por 24 h e / ou 48 h.
2. Expressão de proteínas por microarray do ciclo celular do anticorpo
- Semear 5 x 105 células para cada amostra em frascos T25 cm2 e realizar uma transfecção de acordo com o protocolo descrito na seção 1, etapas 1-5.
- Após 24 h e 48 h, colher células por tripsinização.
- Transfira as suspensões de células para tubos de 15 mL e rotule-as de acordo.
- Centrifugue a 751 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante.
- Adicione 2 mL de PBS 1x gelado, vórtice e centrifugue a 751 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante.
- Repita a etapa de lavagem com 1x PBS.
- Adicione 150 μL de tampão de lise suplementado com inibidores de protease. Pipet para cima e para baixo suavemente para romper as membranas celulares.
- Para evitar qualquer interferência do tampão de lise, execute uma troca de tampão para substituir o tampão de lise por tampão de rotulagem, usando as colunas de troca de solvente do fabricante.
- Quantifique a proteína total com um ensaio de BCA.
- Pegue 70 μg de amostra de proteína e adicione tampão de marcação para atingir um volume final de 75 μL.
- Adicione 100 μL de dimetilformamida (DMF) a 1 mg de reagente de biotina (biotina/DMF).
- Adicionar 3 μL de biotina/DMF a cada amostra de proteína (amostra de proteína biotinilada) e incubar durante 2 h em RT.
- Adicione 35 μL de reagente de parada e misture por vórtice.
- Incubar amostras em RT por 30 min.
- Remova as lâminas de microarray da geladeira para que aqueçam até RT por 1 h antes de usar.
- Realizar o bloqueio da ligação não específica incubando as lâminas com solução de leite em pó a 3% (em reagente bloqueador fornecido pelo fabricante) numa placa de Petri com agitação contínua durante 45 min em RT.
- Lave as lâminas com água ddH2O (a menos que especificado de outra forma, a lavagem é feita com ddH2O).
- Repita a etapa de lavagem ~ 10x para remover completamente a solução de bloqueio das superfícies das corrediças. Isso é importante para obter um fundo uniforme e baixo.
- Remova o excesso de água das superfícies das lâminas e prossiga para a próxima etapa sem deixar as lâminas secarem.
- Prepare a solução de acoplamento dissolvendo o leite em pó a 3% em um reagente de acoplamento.
- Adicione 6 mL da solução de acoplamento e à quantidade total da amostra de proteína biotinilada previamente preparada da etapa 12.
- Coloque uma lâmina em um poço da câmara de acoplamento fornecida pelo fornecedor e adicione ~6 mL de mistura de acoplamento de proteína.
nota: Certifique-se de que a lâmina esteja completamente submersa em solução de mistura de acoplamento de proteínas.
- Cobrir a câmara de engate e incubar durante 2 h em RT com agitação contínua num agitador orbital.
- Transfira as lâminas para uma placa de Petri e adicione 30 mL de 1x tampão de lavagem. Coloque a placa de Petri em agitador orbital, agite por 10 min e descarte a solução.
- Repita a etapa 24 2x.
- Enxágue as lâminas com água ddH2O extensivamente conforme descrito nas etapas 17 e 18 e prossiga para a próxima etapa imediatamente para evitar a secagem.
- Adicione 30 μL de Cy3-estreptavidina (0,5 mg / mL) em 30 mL de tampão de detecção.
- Coloque a lâmina em uma placa de Petri e adicione 30 mL de tampão de detecção contendo Cy3-estreptavidina.
- Incubar em agitador orbital por 20 min com agitação contínua protegida da luz.
nota: Cy-3 é um corante fluorescente. Cubra com papel alumínio ou opere em condições escuras para manter a intensidade da fluorescência.
- Execute as etapas 24-26 e deixe a lâmina secar usando um jato de ar suave ou colocando a lâmina em um tubo cônico de 50 mL e centrifugue a 1300 x g por 5-10 min.
- Coloque o slide no suporte deslizante e cubra com papel alumínio.
- Digitalize a lâmina em um scanner de microarray com os comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados. No caso de Cy3, o pico de comprimento de onda de excitação é de ~550 nm e o pico de emissão de ~570 nm.
- Analise os dados (consulte a Tabela de Materiais para o software usado).