Preparação de Pulmão de Camundongo para Citometria de Fluxo: Gerando Suspensão Celular do Tecido Pulmonar para Análise de Citometria de Fluxo

Resumo

Fonte: Moll, H. P., et al. Transplante ortotópico de células de adenocarcinoma de pulmão singênico para estudar a expressão de PD-L1. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve a preparação da suspensão de células pulmonares de camundongo para análise de citometria de fluxo para estudar a expressão de PD-L1 de células de adenocarcinoma de pulmão.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação pulmonar para citometria de fluxo

1. No ponto final experimental desejado, sedar o camundongo por uma injeção subcutânea de uma mistura de cetamina (100 mg / kg de peso corporal) e xilazina (10 mg / kg de peso corporal) e sacrificá-lo por luxação cervical.
2. Mergulhe a carcaça em etanol a 70% e prenda o mouse em uma placa de dissecação usando fita adesiva.
3. Faça uma incisão na linha média ventral e inverta suavemente a pele para expor os músculos da parede torácica e os órgãos abdominais. Perfure o diafragma e corte as costelas com uma tesoura para expor a cavidade torácica.
4. Perfunda os pulmões 3x com 6 a 8 mL de PBS gelado através do ventrículo direito usando uma agulha 27 G depois de cortar uma pequena abertura no ventrículo esquerdo para permitir que o sangue saia. Os pulmões devem ser limpos de sangue e ficar completamente brancos.
5. Retire os pulmões e pique os lóbulos em pedaços pequenos usando uma tesoura. Transfira os pedaços de pulmão para um tubo de microcentrífuga de 2 mL e incube-o em 1,5 mL de tampão de digestão pulmonar (RPMI, 5% FCS, 150 U / mL de colagenase I e 50 U / mL de DNase I).
6. Incubar os pedaços pulmonares 30 - 60 min a 37 °C e com agitação constante.
7. Transfira a suspensão de células pulmonares através de um filtro de células de 70 μm para um tubo de 50 mL. Limpe o filtro com as costas de uma seringa estéril de 10 mL e enxágue o filtro com 15 mL de PBS com 2% de FCS.
8. Centrifugar as células a 300 x g durante 5 min a 4 °C e aspirar o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 mL de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK) e incube-as por 5 min em temperatura ambiente para a lise de eritrócitos residuais.
9. Centrifugue as células a 300 x g por 5 min a 4 ° C e ressuspenda as células em 1 mL de PBS com 2% FCS e prossiga com o protocolo de coloração desejado para citometria de fluxo
   nota: Alternativamente, as células podem ser ressuspensas em RPMI contendo 30% de FCS e 10% de DMSO e congeladas usando um recipiente de congelamento para análise posterior.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linha celular de adenocarcinoma de pulmão de camundongo			isolado internamente
Camundongos C57Bl/6			F1 da cruz dos dois fundos pode ser usado (8-12 semanas)
Ratos 129S
RPMI 1640 Médio	Tecnologias da Vida	11544446
Soro fetal de bezerro	Tecnologias da Vida	11573397
Solução de penicilina/estreptomicina	Tecnologias da Vida	11548876
L-Glutamina	Tecnologias da Vida	11539876
Ketasol (100 mg/mL de cetamina)	Ogris Pharma	8-00173
Xilasol (20 mg/mL de xilazina)	Ogris Pharma	8-00178
Pinça romba	Roboz	RS8260
Tesoura de íris de estudante	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 91460-11
DNase I (sem RNase)	Biolabs da Nova Inglaterra	M0303S
Colagenase Tipo I	Tecnologias da Vida	17100017
Buffer de lise ACK	Lonza	10-548E