Ensaio de imunofluorescência: um método para identificar células tumorais capturadas em um fio médico

Resumo

Fonte: Gallerani, G. et.al., Caracterização de células tumorais usando um fio médico para capturar células tumorais circulantes: uma abordagem 3D baseada em imunofluorescência e DNA FISH. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo descreve a técnica de coloração por imunofluorescência de células tumorais circulantes capturadas em um fio médico funcionalizado. O fio funcionalizado permite o isolamento das CTCs in vivo, diretamente da corrente sanguínea do paciente.

Protocolo

1. Imuno-DNA FISH em fio

1. Spike-in de linha celular no fio (suporte 3D)
   nota: A configuração preliminar envolve uma seleção precisa de linhagens de células aderentes com base na positividade de EpCAM. O fio é funcionalizado com anticorpos anti-EpCAM para que apenas as células positivas para EpCAM sejam coradas.
   nota: Não toque na parte funcionalizada do fio para evitar qualquer dano.
   nota: Todas as etapas devem ser realizadas sob uma capela de fluxo laminar em condições estéreis.
   1. Ressuspenda todo o conteúdo de um frasco T75 (80% de confluência) em um frasco de 5 mL usando 4 mL de meio completo; para um único pico, cerca de 2.000.000 de células são recomendadas para maximizar a adesão das células ao fio.
   2. Remova o fio da embalagem de vidro.
   3. Mergulhe a parte dourada funcionalizada do fio no frasco, garantindo que a rolha de fio seja um ajuste estanque para o frasco. Lacre com filme de laboratório.
      nota: Recomenda-se o uso de tubo de 5 mL para permitir uma correspondência correta entre a rolha de fio e o frasco para injetáveis.
   4. Incubar por 30 min em RT em um rotador de tubo (ângulo de 0-120).
   5. Enxágue o fio três vezes em solução PBS 1× usando 3 frascos limpos diferentes.
2. Fixação e permeabilização
   cuidado: A acetona é uma substância inflamável que pode irritar o trato respiratório. Use apenas plásticos resistentes à acetona ou recipientes de vidro (sem PVC ou PVDF).
   nota: Execute estas etapas sob uma capela de exaustão química.
   1. Seque o fio ao ar.
   2. Fixe as células mergulhando o fio em solução de acetona 100% por 10 min em RT. Use um tubo de 5 mL.
      nota: O batente de fio não deve entrar em contato com o fixador.
   3. Seque o fio ao ar por 5 min em RT.
      nota: O protocolo pode ser pausado aqui. O fio deve ser armazenado a -20 °C. Ao embalar o fio para armazenamento de longo prazo, coloque o batente de fio próximo à ponta funcionalizada e insira cuidadosamente o fio no tubo de vidro de armazenamento, tomando cuidado para não danificar a ponta funcionalizada. Feche o copo de armazenamento e guarde (vertical ou horizontalmente) a -20 °C.
3. Imunofluorescência Dia 1
   nota: Esta etapa envolve uma incubação noturna (~ 16 h).
   1. Lavar duas vezes em solução de PBS a 1× com tubo de 5 ml.
   2. Incubar o fio em tampão de diluição de anticorpos durante 30 min a RT utilizando um tubo de 5 ml.
   3. Prepare 150 μL de mistura de anticorpos com uma diluição de anticorpo primário monoclonal conjugado com fluorocromo em tampão de diluição de anticorpos, conforme especificado na folha de dados. Por exemplo, o anticorpo EpCAM-FITC foi usado com uma diluição de 1:20.
   4. Use uma ponta p200 para realizar a incubação, da seguinte maneira: extraia o fio da rolha de fio e insira suavemente o fio através do orifício maior da ponta. Insira a extremidade não funcionalizada primeiro e puxe lentamente o fio pelo orifício menor até que a parte dourada esteja logo além do orifício maior.
   5. Coloque suavemente 150 μL da mistura de anticorpos (por exemplo, anticorpo anti EpCAM_FITC diluído 1:20) na ponta. Para evitar o risco de formação de bolhas, gire suavemente o fio até que a parte funcionalizada esteja completamente mergulhada.
   6. Sele o orifício da ponta. Enrolar filme de laboratório ao redor do orifício pode ajudar.
   7. Incubar verticalmente durante a noite (~ 16 h) no escuro a 4 °C.
4. Imunofluorescência dia 2
   1. Bloqueie a incubação de anticorpos lavando o fio duas vezes em 1× PBS.
   2. Reinsira o fio em seu batente de fio.
      nota: Conservar em 1X PBS a 4 °C num frasco para injetáveis de 5 ml até à realização do ensaio FISH.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
etanol	Carlo Erba	# 414605
Pré-adolescente 20	BIO RAD	# 1706531
PBS (solução salina tamponada com fosfato)	Medicago	# 09-9400-100
acetona	Sigma Aldrich	# 534064-500ML
EM BORRACHAEM CIMENTO	Talens Reais	# 95306500
EpCAM-FITC (clone: HEA-125)	Mitenyi	#130-080-301
RPMI 1640	Gibco	# 31870-025
XT ALK BA	Sondas MetaSystems	# D-6001-100-OG
Detektor CANCER01 EpCAM	Gilupi Nanomedizin		Fio funcionalizado
Microscópio Fluorescente ZEISS Axioskop	Zeiss
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bits software	Nikon
Câmera digital Nikon DS-QiMc de 12 bits	Nikon	DS-QiMc