Extração de miRNA: Um método para extrair miRNA de amostra de plasma

Resumo

Fonte: Mensah, M. et. al., Biópsia líquida baseada em microRNA: a experiência do classificador de assinatura de miRNA plasmático (MSC) para rastreamento de câncer de pulmão. J. Vis. Exp. (2017).

MicroRNAs (miRNAs) são RNAs específicos do tecido, pequenos e não codificantes que regulam a expressão gênica e podem representar candidatos ideais para a detecção precoce do câncer de pulmão. No protocolo apresentado, isolaremos o microRNA de amostras de sangue de pacientes para rastreamento precoce do câncer de pulmão.

Protocolo

1. Coleta de amostras de plasma

1. Colete 10 mL de amostra de sangue total em tubos Vacutainer com K₂EDTA revestido com spray e armazene em temperatura ambiente.
   nota: Para minimizar a hemólise, separe o plasma em 2 h. Não armazene o sangue total a baixa temperatura (ou seja, 4 °C) para evitar choque térmico e lise celular que levam a uma libertação inespecífica de miRNA.
2. No espaço de 1 h, separar o plasma por um primeiro passo de centrifugação a 1,258 x g e 4 °C durante 10 min.
3. Transfira o sobrenadante plasmático para um tubo de 15 ml, evitando cuidadosamente o contacto com o anel linfocítico.
4. Centrifugar o plasma uma segunda vez a 1.258 x g e 4 °C durante 10 min.
5. Alíquota de 1 mL de plasma em criogeniais de 1,5 mL, evitando coletar a fração plasmática na base do tubo.
6. Armazenar todas as alíquotas a -80 °C, exceto uma para a avaliação da hemólise. A análise molecular deve ser realizada dentro de 5 semanas.

2. Extração de RNA Total de Plasma

1. Prepare uma solução de 1-tioglicerol / homogeneização (OMG) com 20 μL de 1-tioglicerol por mL de solução de homogeneização. Como o 1-tioglicerol é viscoso, pipete cuidadosamente para uma medição precisa. Resfrie a solução OMG no gelo ou a 2-10 ° C antes de usá-la.
   nota: A solução de trabalho é estável a 2-10 °C por 1 mês.
2. Suspenda a DNase I liofilizada adicionando 275 μL de água livre de nuclease no frasco e misture suavemente (não vórtice). Como auxílio visual, adicione 5 μL de corante azul à DNase I reconstituída e dispense a solução em alíquotas de uso único em tubos sem nuclease. Armazene a DNase I reconstituída a -30 °C a -10 °C.
3. A partir de 200 μL de plasma, adicione 200 μL da solução OMG resfriada.
4. Vórtice 15-30 s para garantir uma homogeneização completa. Se ocorrer formação de espuma, deixe a amostra assentar no gelo.
5. Adicione 200 μL de tampão de lise e 25 μL de proteinase K à amostra homogeneizada e vórtice por 20 s.
6. Incubar as amostras durante 15 min num termomixer pré-aquecido a 37 °C.
7. Carregue um cartucho para cada sample na bandeja do convés do instrumento e coloque o plugger na posição correta.
8. Transfira o lisado para a posição apropriada no cartucho do instrumento.
9. Adicione 5 μL de solução de DNase I na posição correta no cartucho.
10. Adicione 60 μL de água livre de nuclease à base de cada tubo de eluição.
11. Selecione o método "RSC miRNA Tissue" e inicie a execução de purificação automatizada. As amostras totais de RNA podem ser armazenadas a -80 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1x PBS	Lonza	BE-17-516
Tampão 20xTE, pH 8,0	Sonda molecular	T11493	Diluir a solução estoque 20X para obter a concentração final de 0,1X em água livre de nuclease
Água livre de nuclease
Kit de tecido de miRNA Maxwell RSC	Promega	AS1460	O kit contém Solução de Homogeneização, DNase I, Proteinase K, Tampão de Lise e cartuchos. Para o 1-tioglicerol, a inalação e o contato com a pele e os olhos devem ser evitados. Use-o sob um armário de exaustão.
Conjunto de coleta de sangue Vacutainer Safety-Lock	Becton Dickinson	Rolamento 367286-364815
Misturador de vórtice	Velp Scientifica	F202A0173
Agitador em T ThermoMixer	Euroclone	A00564	Leve o Thermo Mixer a 37 °C antes de iniciar a extração de RNA
Instrumento Maxwell RSC	Promega	AS4500
Frascos criogênicos 1,5 ml	Sigma-Aldrich	Z359033