Coloração imuno-histoquímica: um método para obter informações espaciais de seções de tecido fino

Abstract

Fonte: Baharom F. et al., Células dendríticas do pulmão humano: distribuição espacial e identificação fenotípica em biópsias endobrônquicas usando imuno-histoquímica e citometria de fluxo. J. Vis. (2017)

Este vídeo descreve a técnica de coloração imuno-histoquímica para identificar células dendríticas a partir de biópsias endobrônquicas.

Protocol

1. Seccionamento GMA.

1. Prepare a solução de amônia a 0,05% com água destilada. Coloque a faca de vidro e a biópsia no micrótomo. Alinhe cuidadosamente o bloco de biópsia com a lâmina, ajustando o porta-faca e o ângulo do bloco de biópsia para que a lâmina fique plana contra a superfície do bloco.
2. Corte seções de 2 μm de espessura usando o micrótomo em uma velocidade de corte lenta e use uma pinça para transferir e flutuar as seções na água de amônia. Flutue as seções por 45-90 segundos, permitindo a recuperação suave do antígeno e o desdobramento da seção.
3. Pegue seções com lâmina de microscópio. Verifique a histologia da biópsia colorando-se rapidamente com azul de toluidina.
4. Secar as lâminas numa placa de aquecimento regulada para 50 °C e aplicar 500 μl de corante azul de toluidina filtrada numa secção com uma pipeta de plástico Pasteur. Aqueça a seção na placa quente até que um anel verde comece a emergir na borda da mancha e, em seguida, lave-a com água.
5. Usando um microscópio óptico, verifique a histologia da biópsia. Os cortes usados para imuno-histoquímica devem conter boas áreas de lâmina própria e epitélio não danificados, com o menor número possível de glândulas e o mínimo de músculo liso.
6. Corte seções com boa histologia e pegue-as com lâminas de microscópio revestidas com poli L-lisina (revestidas com PLL) para coloração imuno-histoquímica. Corte pelo menos duas seções de cada biópsia para análise. Seque as lâminas por pelo menos 1 hora. Após a secagem, as seções podem ser embrulhadas em papel alumínio e armazenadas a -20 °C por até 2 semanas, ou podem ser imediatamente imunomarcadas.

2. Coloração imuno-histoquímica de biópsias endobrônquicas incorporadas em GMA

NOTA: A azida sódica é tóxica. Prepare a solução de azida sódica a 0,1% dentro de uma capela e longe de ácidos. O contato com ácidos libera gases tóxicos.

1. Desenhe ao redor das seções usando uma caneta com ponta de diamante e arrume as lâminas em uma grade de coloração.
2. Execute um bloqueio de peroxidase. Prepare uma solução em bloco de peroxidase de peróxido de hidrogênio a 0,3% em solução de azida sódica a 0,1%. Aplicar 1 ml do bloco de peroxidase nas secções e incubar durante 30 min.
3. Prepare uma solução de lavagem de solução salina tamponada com Tris 0,05 M (TBS), pH 7,6. Lave as lâminas em TBS, 3x 5 min.
4. Prepare uma solução de bloco BSA a 1% em DMEM. Faça isso com antecedência e em grandes volumes, alíquota e congele até que seja necessário. Drene as lâminas e incube as seções em solução em bloco por 30 min para bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos. Se ainda ocorrer ligação inespecífica, inclua uma etapa de incubação de 30 minutos com bloqueio sérico de 5% da mesma espécie que o anticorpo secundário.
5. Diluir o anticorpo primário (CD45 ou CD1a) em TBS até a concentração desejada (CD45 diluído a 1:1.000; CD1a diluído a 1:1,00) e aplicá-lo nas lâminas. Cubra as seções e incube durante a noite em RT.
6. Lave as lâminas em TBS três vezes. Diluir o anticorpo secundário biotinilado (dirigido contra a espécie hospedeira do anticorpo primário, neste caso o anti-rato de coelho F(ab'₂)) em TBS até à concentração desejada (diluição de 1:300) e aplicá-lo nas lâminas. Incubar por 2 horas em RT.
7. Prepare um complexo estreptavidina biotina-peroxidase pelo menos 30 minutos antes de usar. Certifique-se de que haja o suficiente para cobrir todos os slides. Lave as lâminas em TBS três vezes. Aplique a solução nas lâminas e incube por 2 horas em RT.
8. Lave as lâminas em TBS três vezes. Prepare a solução de substrato da peroxidase 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) (feita de acordo com as instruções do fabricante). Aplique nas lâminas e incube por 20-30 min ou até que a intensidade de mancha desejada se desenvolva.
9. Enxágue as lâminas em água corrente da torneira por 5 min. Contra-marque as seções com solução filtrada de hematoxilina de Mayer por 2 min. Lave as lâminas em água corrente da torneira por 5 min.
10. Drene as lâminas e cubra as seções com meio de montagem aquoso permanente. Secar as lâminas a 80 °C numa estufa de secagem. Deixe os slides esfriarem e, em seguida, monte-os com DPX e coloque uma lamínula.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seccionamento GMA
Lâminas de microscópio de vidro	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	Bordas cortadas, extremidade fosca
Solução de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	1:10 para solução de trabalho
Tiras de vidro para ultramicrotomia	Alkar
Pré-adolescente 20	Sigma-Aldrich	Pág. 2287	Solução de lavagem (0,1% Tween20)
LKB 7800B Fabricante de facas	LKB
Divisor de cápsulas	Laboratórios TAAB	C065
Lâminas de borda única em aço carbono	Laboratórios TAAB	B054
vício
Amônia, 25%	VWR	1133,1	2 ml em 1 L, 1:500 (0,05%)
Micrótomo	Leica		Leica RM 2165
luz	Leica		Leica CLS 150 XE
Microscópio com suporte de braço oscilante	Leica		Leica MZ6
Imuno-histoquímica GMA
Caneta com ponta de diamante	Histolab	Rolamento 5218
Solução de peróxido de hidrogênio a 30%	AnalaR Normapur	Rolamento 23619.264
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
cloreto de sódio	Produtos químicos da VWR	Rolamento 27810.295
Albumina de soro bovino	Millipore	82-045-2	Grau diagnóstico de Probumin BSA
Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anticorpo anti-CD45 humano	BioLegend	304002	Monoclonal de camundongo, clone HI30, isotipo IgG1k. Concentração de trabalho de 500 ng/ml
Anticorpo anti-CD1a humano AbD	Serotech	MCA80GA	Monoclonal de camundongo, clone NA1/34-HLK, isotipo IgG2a. Concentração de trabalho de 10 μg/ml
Isotipo monoclonal de IgG1 de camundongo Controle	Abcam	AB27479
Isotipo monoclonal de IgG2a de camundongo Controle	Dako	X094301-2
Kit padrão Vectastain ABC Elite	Laboratórios de vetores	PK-6100
AEC (3-amino-9-etilcarbazol) papagaio substrato de peroxidase	Laboratórios de vetores	SK-4200
Hematoxilina de Mayers	HistoLab	1820
Montagem Aquosa Permanente Média	AbD Serotech	BUF058C
Forno de secagem
Solução de montagem permanente DPX	VWR	360292F
Microscópio óptico	Leica		Leica DMLB
Câmera para microscópio	Leica		Leica DFC 320
Software de análise	Leica		Leica Qwin V3